2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）感染猪进行病毒分离鉴定，并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测，对检测为阳性的病料进行PCV2的分离，利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因，经克隆、测序后，用MEGA5．1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒，分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示，感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1767bp，与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92．6％～99．9％，2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96．0％，与PCV1核苷酸序列同源性分别为74．6％和77．7％。系统进化树分析结果显示，2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近；PCV2核苷酸序列比较稳定，其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2，ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a，JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T-A-vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET-Avp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET-A-vp1的E.coli BL21(DE3)菌后,SDS-PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37℃条件下,IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导表达6h后,VP1蛋白的表达量最大。Western-Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。

猪细小病毒河南分离株全基因组克隆及序列分析

[目的]进一步了解河南地区猪细小病毒（PPV）的变异特点。[方法]利用PCR方法,对河南郑州、周口、济源等地采集的疑似PPV感染的病料进行检测。PCR检测为阳性的病料经处理后,同步接种猪睾丸细胞盲传6代,对4株PPV全基因组进行分段克隆及测序,并与Gen Bank登录的国内外PPV流行株全基因组进行比较。[结果]获得的4株PPV全基因组序列全长均为4 679 bp。4个毒株之间的核苷酸同源性介于99.6%-99.8%,与其他毒株间核苷酸同源性为98%-100%,遗传进化较为稳定。[结论]为PPV在河南地区分子流行病学调查及遗传变异分析奠定了基础。

猪圆环病毒2型河南株全基因组的克隆与遗传进化分析

为了解近几年河南地区猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传进化情况,本研究对采自2011年-2015年河南省13个地区的28份疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）猪的病料样品进行PCR检测,并将检出的阳性病料样品接种无PCV的PK-15细胞,分离PCV2,进而用IPMA进行鉴定。最后对所获分离株进行全基因组克隆和序列分析。结果显示,28份样品中阳性率为75%（21/28）,并成功分离出21株PCV2,其全基因序列同源性为95.4%-99.9%;在遗传演化关系上,21株PCV2分离株分布于两个基因型（PCV2b和PCV2d）,16株属于PCV2d,而其余5株属于PCV2b基因型,这也说明PCV2d逐渐成为河南地区的优势流行株。此外,通过对其Cap蛋白氨基酸序列的预测与分析,发现其主要抗原区存在12处位点明显变异,这可能影响其抗原性及免疫原性。本研究为河南地区PCV2的防控提供了依据。

免疫系统的感知和信号传导

信号感知和传导是免疫系统对致病因素进行适当反应和维持机体内环境稳态的关键。尽管炎症性免疫应答对于消除暂时性微生物入侵和保护机体不受继发感染来说是很必要的，但是过度的免疫或者对无害物质的主动免疫则是有害的，因为会导致慢性的组织损伤。

猪圆环病毒2型ORF2基因截断表达及ELISA抗体检测方法的初步建立

为建立以重组PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET28a-ORF2。SDS-PAGE显示,在0.1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导4h,重组Cap蛋白高效表达。Western blotting证实该蛋白能够被PCV2阳性血清特异性识别。以纯化的蛋白为抗原建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最适包被质量浓度为2mg/L;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗最适浓度为1∶2 000,该方法的敏感性为86.96%,特异性为100%。用该方法对河南省152份猪血清样品进行检测,与间接免疫荧光(IFA)的符合率为85.53%(130/152),与商品化的韩国金诺PCV2ELISA试剂盒的符合率为88.16%(134/152)。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。