报告抗原腘窝淋巴结试验评价注射用双黄连的致敏性

目的利用报告抗原腘窝淋巴结试验(reporter antigen popliteal lymph node assay,RA-PLNA)评价注射用双黄连(Shuanghuanglian for injection,SHLI)的致敏性,并探讨其发生机制。方法 SPF级7~8周雌性BALB/c小鼠,按体重随机分为生理盐水空白对照组(Veh)、D-盐酸青霉胺阳性对照组(D-pen,1 mg/只)、SHLI高剂量组(H,5 mg/只)和低剂量组(L,1 mg/只),共4组,6只/组。将受试物分别与TNP-OVA(10μg/只)混合,右侧足趾部皮下注射给予小鼠,终体积50μL/只。药后7天处死动物,摘取两侧腘窝淋巴结(popliteal lymph node,PLN),称重,计算重量指数(weight index,WI);制备单细胞悬液,计算细胞指数(cells index,CI),比较各组的RA-PLNA反应。ELISPOT检测PLN中的TNP特异性抗体分泌细胞(AFC)的数量和类型,流式细胞术检测PLN中淋巴细胞和巨噬细胞数量。与TNP-Ficoll混合时,另取小鼠,方法同上。结果分别与两种报告抗原一起注射后,高剂量的SHLI诱导明显的RA-PLNA阳性反应(组平均WI≥2或CI≥5);ELISPOT检测发现,仅高剂量SHLI和TNP-OVA一起注射明显增加TNP特异性AFC的数量,且分泌各类抗体的AFC均明显升高(P<0.05或P<0.01);流式细胞术检测发现高剂量SHLI与TNP-OVA一起可升高PLN中巨噬细胞的数量(P<0.05)。结论在BALB/c小鼠体内SHLI不会形成新的抗原表位,也不会活化特异性T细胞,提示SHLI本身可能不具有致敏潜能。

人免疫系统重建NPG小鼠不能诱发直接腘窝淋巴结试验阳性反应

目的观察阳性药物D-盐酸青霉胺(D-pen)和链脲佐菌素(STZ)诱发的人免疫系统重建NPG(hu-NPG)小鼠的直接腘窝淋巴结试验(d-PLNA)反应,并比较其与NPG和BALB/c小鼠反应的异同,探索可提高药物超敏反应预测价值的模型动物。方法雌性NPG小鼠,1.8 Gy的X线辐照后,植入人脐血造血干细胞,制备hu-NPG小鼠,取外周血,进行淋巴细胞表型分析及淋巴细胞增殖实验。hu-NPG,NPG和BALB/c小鼠各10只,每种小鼠随机分成D-pen和STZ组,每组5只。各组分别在右后肢足趾部sc给予D-pen每只1 mg或STZ 0.75 mg,左后肢不做处理作为对照。注射后7 d处死小鼠,取左、右侧腘窝淋巴结称重,计算质量指数;将淋巴结制成单细胞悬液,计算细胞指数,并对部分淋巴结进行组织病理学检查,以比较d-PLNA反应。结果注射阳性药物D-pen和STZ后,各组小鼠一般状态良好,均未见全身毒性,且至处死时局部炎性刺激症状消失。D-pen和STZ均能诱导BALB/c小鼠出现典型的d-PLNA阳性反应,表现为注射侧淋巴结质量和细胞数量比对照侧增加,平均质量指数≥2或平均细胞指数≥5。而NPG小鼠和hu-NPG小鼠均未出现阳性反应。病理学检查发现,NPG和hu-NPG小鼠的腘窝淋巴结体积明显小于BALB/c小鼠,发育不完善。淋巴细胞表型分析发现,NPG小鼠仅有少量淋巴细胞,而hu-NPG小鼠外周血中人源性淋巴细胞以CD45^+CD19^+的B细胞为主,CD45^+CD3^+T细胞较少,且丝裂原不能刺激NPG和hu-NPG小鼠体内的人源或鼠源性淋巴细胞增殖。结论 D-pen和STZ所致的小鼠d-PLNA阳性反应依赖于体内正常的淋巴细胞数量及功能。NPG小鼠缺乏正常淋巴细胞,d-PLNA反应阴性。hu-NPG小鼠体内的人淋巴细胞功能不全,也不能诱发阳性反应。因此,hu-NPG小鼠尚不能成为d-PLNA的敏感动物。

基于小鼠嗜碱性粒细胞活化致敏性模型的建立

目的研究BALB/c致敏小鼠外周血中嗜碱性粒细胞表面分子CD63表达情况,构建小鼠嗜碱性粒细胞激活试验(BAT)模型以评价小分子药物(LMWC)致敏性。方法以流式细胞术(CD45 APC^(low)/IgE FITC^(high))和瑞氏-姬姆萨染色血涂片检测对照组和卵清蛋白(OVA)致敏小鼠(OVA致敏组)嗜碱性粒细胞的形态和数量;以CD45 APC^(low)/IgE FITC^(high)作为鉴定小鼠嗜碱性粒细胞的流式方案,anti-IgE为阳性对照体外与小鼠嗜碱性粒细胞孵育,观察CD63的表达,建立小鼠BAT模型;以青霉素G和BSA的耦联物(PG/BSA)致敏小鼠(PG/BSA致敏组),青霉素G和OVA的耦联物(PG/OVA)体外激发,验证模型的有效性。结果与对照组小鼠相比,OVA致敏组小鼠嗜碱性粒细胞的形态和数量差异无统计学意义(P=0.655,P=0.667);anti-IgE体外可刺激小鼠嗜碱性粒细胞表面CD63的表达;OVA致敏组小鼠外周血体外与OVA孵育后,CD63表达高于对照组[(59.70±37.93)%vs(2.15±1.13)%,差异有统计学意义(P=0.016);PG/BSA致敏组小鼠的外周血体外与PG/OVA孵育后,CD63表达高于对照组[(62.74±41.05)%vs(2.73±1.40)%],差异有统计学意义(P=0.019)。结论特定致敏原体外可引起已致敏小鼠的CD63表达上升,表明成功构建了小鼠BAT模型,并以PG验证了此模型的有效性,其可用于评价LMWC的致敏性。