树突状细胞负载肝癌可溶性抗原后的免疫应答

目的用负载肝癌可溶性抗原的DC诱导肝癌特异性T细胞。方法在体外用GM-CSF和IL-4诱导健康人外周血单核细胞，使其分化为高纯 度树突状细胞（DC）。用负载人肝癌细胞株SMMC-7721可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞。结果诱导后淋巴细胞增殖指数大于1.5，表面CD56分子表达下降，CD3+ T / CD4+ T和CD3+ T / CD8+ T细胞比例增加，以CD3+ T / CD4+ T细胞比例增 加最为明显。CD4 / CD8比例由诱导前的0.84增加为1.04, 活化前后γ δ+ T比例没有改 变。活化后的淋巴细胞不但可杀伤SMMC-7721细胞，同时还可不同程度的杀伤其它3株肝癌 细胞。另外，诱导7 d的DC可不同程度的抑制4株肝癌细胞和胃癌细胞。结论实验结果为肝癌DC疫苗的研究提供了理论基础。

中国海域分离的啮氏艾肯菌致病性和抗生素敏感性研究

目的就中国海域分离的啮氏艾肯菌对小鼠的毒力及伤口感染情况进行研究,并进行抗生素敏感性实验。方法昆明小鼠腹腔注射啮氏艾肯菌悬液,观察一般状态、白细胞计数和血培养。第5天脱颈处死后解剖取脏器甲醛固定,石蜡包埋、制片,HE染色,光镜观察;昆明小鼠致伤后浸泡在含啮氏艾肯菌的人工海水中45～60min,打捞后分笼于层流柜中饲养。于致伤浸泡后不同时间做白细胞计数及血培养,并观察一般状态和伤口炎性反应,定时取伤肢分泌物做细菌培养;实验完毕后伤肢甲醛固定,石蜡包埋、制片,HE染色,光镜检查;用K-B法做啮氏艾肯菌对各种抗生素药物敏感性实验。结果小鼠注射啮氏艾肯菌液后,白细胞升高,感染12h后20%小鼠心和肝脏有细菌生长。小鼠感染啮氏艾肯菌后,病变部位以肺、肝及肾脏为重,病变性质主要是造成血液循环障碍,引起不同程度的充血、出血及血停滞现象。致伤小鼠经含啮氏艾肯菌的海水浸泡后,6、12、24、48、72h伤肢培养均为阳性,感染后48h时20%小鼠肠组织细菌培养阳性,其余时间点和其他组织细菌培养均为阴性。伤肢组织可见肌纤维排列疏松、紊乱、断裂,横纹肌间较多炎细胞浸润。啮氏艾肯菌对复方新诺明、哌拉西林、美洛培南、磺胺的敏感性仅为67%,对其他抗生素均表现为敏感。结论中国海域分离的啮氏艾肯菌具有致病力,啮氏艾肯菌对复方新诺明、哌拉西林、美洛培南、磺胺的敏感性较低,对其他抗生素均表现为敏感。

肝癌DC疫苗诱导CTL的效应与机理研究

目的 探讨肝癌DC疫苗诱导肝癌特异性淋巴细胞的效应与机理。方法 用流式细胞术检测肝癌细胞表面HLA-DR的表达;用CM-CSP和IL-4从健康人外周血诱导DC,使之负载肝癌相关抗原,并在BCG HSP-70作用下活化,制成肝癌DC疫苗;用流式细胞术检测BCG HSP 70活化的负载肝癌抗原DC对自身淋巴细胞的活化;分别用MIT法和ELISA检测肝癌DC疫苗活化的淋巴细胞培养上清中TNF和IL-12水平;用原位杂交检测淋巴细胞内IFN-γmRNA表达;用流式细胞术检测经DC疫苗活化后淋巴细胞表面Fas-L表达;最后检测肝癌DC疫苗活化的淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤。结果 肝癌DC疫苗在体外诱导活化的淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤以CD4^+ T CTL为主,不但可以杀伤SMMC-7721细胞,同时对其它3种肝癌细胞也有不同程度的杀伤。CTL培养上清液和细胞中可分别检测到T_(HI)型细胞因子TNF和IFN-γ mRNA。Fas和Fas配体途径发挥了重要的作用。结论 为肝癌DC疫苗的进一步深入研究及今后的临床应用奠定了良好的基础。

当归多糖对免疫细胞增殖作用的实验研究

探讨当归多糖对免疫细胞的直接和间接作用。用MTT法分别检测当归多糖 (PCA)对PBMC的直接作用、PCAPBMC培养液对PBMC的间接作用 ;用流式细胞术检测PCA作用于健康人PBMC后各种免疫细胞表型的改变 ;检测PCA注射BALB/c小鼠后脾细胞增殖变化和巨噬细胞的吞噬能力。当归多糖对PBMC具有直接的抑制作用 ,而当归多糖PBMC培养液可促进PBMC增殖。PCA注射BALB/c小鼠后脾细胞增殖能力和巨噬细胞吞噬能力均得到了不同程度的增强。研究结果为进一步阐明当归多糖的免疫机理提供了理论依据。

蓖麻毒素快速ELISA检测法的建立

目的:建立蓖麻毒素快速ELISA检测方法。方法:从8株抗蓖麻毒素的杂交瘤细胞中,筛选亲和力较高的单克隆抗体,用Westernblot和ELISA鉴定、ProteinA纯化、HRP标记,经交叉配伍筛选最佳的抗体组合。结果:建立了蓖麻毒素的快速ELISA检测方法,对蓖麻毒素的最低检出浓度为175ng/L,目视检测最低浓度为625ng/L,整个实验不需仪器可在40min内完成检测。结论:蓖麻毒素快速ELISA检测法为蓖麻毒素生物战剂的快速侦检提供了有效手段。

人外周血中树突状细胞的诱导及鉴定

目的 从健康人外周血中诱导高纯度树突状细胞 (dendritic cell,DC)。方法 用贴壁法从健康人外周血获取单核细胞 ,对传统的诱导方法加以改进 ,经 GM- CSF(10 0 ng/ ml)和 IL- 4(5 0 0 U/ m l)持续诱导 7天 ,在此期间不再补充新的细胞因子、新鲜培养基和促成熟因子 ,以获取高纯度 DC。结果 经上述方法处理后 ,从健康人外周血中诱导出了大量高纯度 DC,其能高表达 HL A- 、 类分子、共刺激分子和粘附分子 ,显示出成熟 DC的特征。这些 DC能强烈诱导同种异体淋巴细胞的增埴 ,其内吞能力在第 3天达最高 ,之后明显下降。结论 本研究所建立的从外周血获取大量成熟 DC的方法经济、简便 ,为

人肝癌细胞膜上HSP70的表达

用流式细胞仪和Cell-ELISA检测了 4株人肝癌细胞膜上HSP70的表达。结果表明正常情况下人肝癌细胞膜上HSP70的表达较低 ,经热处理后表达增加 (P <0 0 1)并显示出细胞之间的差异 (P <0 0 1)。推测其低表达可能与肝癌细胞逃逸机体免疫监视有关 ,对制定肝癌的防治对策有重要的指导意义。

血清脂联素水平与肿瘤关系的实验研究

目的:探讨脂联素作为血清学标志物在肿瘤诊断和治疗中的价值。方法:用酶联免疫吸附试验对292例不同肿瘤患者和60名健康人血清中脂联素水平进行检测。结果:正常男女之间血清脂联素水平无差别;60名乳腺癌患者血清平均脂联素水平明显低于30名健康女性平均血清脂联素水平,66名结肠癌患者血清平均脂联素水平明显低于60名健康对照者,胃癌患者血清中脂联素水平与正常人血清脂联素水平无明显差别;肝癌和肺癌患者血清脂联素平均水平略高于正常人,但无统计学意义。结论:乳腺癌和结肠癌患者血清脂联素低于正常人;肝癌、肺癌、胃癌患者体内脂联素与正常人无明显差别。循环系统中低水平脂联素可能是某些肿瘤的危险因素。

EB病毒和人巨细胞病毒核酸检测的实验研究

目的检测血浆和外周血单个核细胞（PBMC）中EB病毒（epsteinbarrvirus，EBV）与人巨细胞病毒（humancyto—megalovirUs，HCMV）DNA含量，以期为两种病原体的早期诊断与监测提供敏感、准确、及时的实验室结果，并为两种病原体感染的实验室诊断筛选出适宜的标本类型。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（realtime—PCR）分别对270份血浆和外周血单个核细胞中EB痛毒和HCMV病毒进行核酸检测并分析。结果270份血浆和外周血单个核细胞中EBVDNA检出率分别是30％和96．7％，血浆和外周血单个核细胞两种类型标本检测EBVDNA的联合检出率为100％；血浆和外周血单个核细胞两种类型标本对HCMVDNA检出率分别是40％和86．7％，两种类型标本对HCMVDNA的联合检出率为100％。结论外周血单个核细胞标本对EB病毒和HCMV的检出率明显高于血浆标本，血浆和单个核细胞两种类型标本对EBVDNA和HcMVDNA的联合检出率为100％。临床医生在疑似EBV和HCMV感染患者的诊疗中要选择适宜的标本类型；首选外周血单个核细胞标本进行检测，条件允许的情况下与血浆标本联合检测，以提高检测的敏感性和准确性。

胃癌组织CD1α和survivin表达及临床意义

目的:观察胃癌组织中树突状细胞及树突状细胞前体的分布,并探讨survivin作为胃癌生物治疗靶抗原的可能性.方法:用免疫组织化学染色对不同类型胃癌组织132例(中分化腺癌72例,低分化腺癌60例)CD1α,CD68,S100和survivin蛋白的表达进行了检测.结果:中分化腺癌CD1α表达率为33%(24/72),低分化腺癌CD1α表达率为10%(6/60),二者有显著性差异(X2=6.56,P<0.05).中分化腺癌$100表达率为50%(36/72),低分化腺癌表达率30%(18/60),二者无显著性区别(P>0.05).CD1α阳性胃癌组织S100表达均阳性,二者有良好的一致性.中分化腺癌CD68表达为91.6%(66/72),低分化腺癌表达率为60%(36/60),二者无显著性差别(P>0.05),CD68和CD1α在中分化腺癌和低分化腺癌中的分布也有良好的一致性.Survivin在中分化腺癌的表达为91.7%(66/72),低分化腺癌表达为90%(54/60),二者无显著性差别(P>0.05).结论:survivin和DC的结合在胃癌生物治疗中具有潜在而重要的应用价值,以survivin为靶抗原的胃癌个体化DC疫苗值得进一步深入研究.

基于蓖麻毒素B链的新型黏膜免疫佐剂设计及靶向效果初步评价

目的:利用自主知识产权抗体3E1,确定RTB与细胞特异性结合的活性肽部位,基因工程合成后,动物实验评价绿色荧光蛋白在基于RTB活性肽靶向下在体内的分布,为后续研究奠定基础。方法:用生物信息学技术,确定RTB与细胞特异性结合的活性肽部位;分子克隆技术构建含不同肽的绿色荧光蛋白原核表达载体,实现肽-GFP融合蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达;动物实验评价小鼠舌下口服肽-GFP融合蛋白后GFP在体内的分布。结果:建立了自主知识产权单抗3E1与RTB相互作用的空间构象,判定出四个活性区域,构建了4个含不同活性肽的GFP原核表达载体,获得了高纯度蛋白;经舌下口服免疫BALB/c小鼠后,免疫组化和流式细胞术证实,P1-GFP免疫组GFP和CD11c在不同组织中的分布与对照组有明显区别。P1-GFP初次免疫后,GFP主要分布于空肠,再次免疫后,GFP主要集中于回肠、肠相关淋巴组织和小肠PP结;初次免疫后CD11c+细胞主要分布于肠系膜淋巴结,胃和空肠,再次免疫后肠系膜淋巴结中的CD11c+细胞不再占优势,空肠中CD11c+细胞明显增加。结论:基于RTB的活性肽P1与GFP融合蛋白口服免疫小鼠后,P1-GFP经P1肽的导向,初次和再次免疫后GFP在体内的分布不同,再次免疫后范围更广。P1的导向使GFP直接进入小肠PP结和肠系膜淋巴结两个黏膜免疫应答的主要诱导及效应部位,利于免疫应答的发生。

基于RTB的新型免疫增强剂构建、表达及免疫效果评估

目的利用自主知识产权抗体3E1,确定蓖麻毒素B链与细胞特异性结合的活性肽部位,通过构建含肽的绿色荧光蛋白原核表达载体,实现含肽的绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的高效、可溶性表达,评价小鼠舌下口服含蓖麻毒素B链肽的绿色荧光蛋白后黏膜免疫应答的能力。方法用生物信息学技术,确定蓖麻毒素B链与细胞特异性结合的活性肽部位;分子克隆技术构建含不同肽的绿色荧光蛋白原核表达载体;镍金属离子鏊合柱纯化目的蛋白;间接ELISA测定小鼠舌下口服不同肽-GFP融合蛋白后各种抗体水平的变化。结果实现了含不同肽的GFP在大肠杆菌中的高效、可溶性表达,获得了纯度大于90%的肽-GFP融合蛋白。免疫小鼠后,小鼠血清中均检测到了较高水平的IgG抗体,其中的P1肽-GFP融合蛋白免疫小鼠血清中检测到了较高水平的IgG2a和IgM抗体。免疫组血清中IgG2b、IgG3、IgA水平与对照组无明显差异。结论分别用4个小分子肽-GFP融合蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中均检测到了较高水平的IgG抗体,其中的P1肽-GFP融合蛋白免疫小鼠的血清中检测到了较高水平的IgG2a和IgM抗体,激发了Th1型免疫应答。

重组蓖麻毒素A链的原核表达和单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的 实现重组蓖麻毒素A链（rRTA）的高效表达,获得rRTA的单克隆抗体,建立基于单抗的蓖麻毒素检测方法.方法 用计算机辅助设计的RNA二级结构预测和偏性密码子等手段设计引物 用PCR将rRTA基因克隆至载体pE132a（＋） 用双酶切和DNA测序技术对构建的载体进行鉴定 IFTG诱导rRTA原核表达载体pET32a（＋）/rRA/BL21,用镍离子亲和层析纯化,ELISA及Western blot鉴定rRTA蛋白 rRTA免疫Balb/c小鼠,建立杂交瘤细胞株,获得抗rRTA的单克隆抗体,用Westem blot鉴定.结果 构建了rRTA原核表达载体pET32a（＋）/rRA/BL21,实现了rRTA在大肠杆菌BL21中的高效可溶性表达,获得了高纯度约10～20 mg/L rRTA 获得抗rRTA的单克隆抗体 建立的ricin EIJSA检测方法检出ricin的最低浓度为3.125 ng/mL,目视比色对蓖麻毒素的最低检出浓度为6.25 ng/mL.结论 本研究表达的rRTA及其单克隆抗体和基于单抗的ricin检测方法,将在肿瘤生物治疗、ricin生物恐怖袭击的侦检、治疗和预防中发挥重要作用.

检验专业实习生沟通能力培养策略探讨

临床实习是检验专业医学生教育中非常重要的一个环节，通过此阶段的实习可把课堂上学到的理论知识和技能转化为临床工作能力“0。在医院实习中，除了继续强调实验室基本操作，增强实习生动手能力的训练之外，更重要是要有效利用医院的学习环境，加强实习生与临床沟通与对话能力的培养[2]。

新型小分子抗体scFv多聚体与肿瘤靶向

新型小分子抗体—单链可变区片段 (sc Fv)是由一弹性接头 (linker)将 VH和 VL 连接而成 ,是抗体具有抗原结合部位的最小功能结构单位。以分子量小、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达、易于基因工程操作等特点而倍受关注。依据接头的长度和 V区的方向 ,sc Fv分子可聚集形成二聚体 (Diabody)、三聚体 (tri-abody)和四聚体 (tetrabody)。我们就 sc Fv分子接头长度和 V区方向、sc Fv多聚体的表达和稳定性、sc Fv多聚体在体内的药代动力学、sc Fv多聚体的弹性和亲和力、鼠源性 sc Fv多聚体的体外应用、多特异性 Sc

肝癌患者树突状细胞功能及状态的研究

目的 :评价肝癌患者体内树突状细胞的功能与状态 ,为肝癌DC疫苗的研制奠定基础。方法 :改进目前国内外普遍使用的DC诱导方法 ;用改进后的DC诱导方法 ,诱导肝癌患者DC ,检测DC表面各种分子的表达及其诱导同种异体淋巴细胞转化的能力和DC培养上清中TNF和IL - 1 2水平。结果 :经GM -CSF和IL - 4联合诱导 ,平均从 1 0 0ml健康人外周血中诱导出 9.7× 1 0 6 个DC ,诱导出 9.2× 1 0 6 个CD83+ 成熟DC ,CD83分子表达明显高于国内报道 ;健康人DC诱导同种异体淋巴细胞转化的能力高于肝癌患者 ,但肝癌患者和健康人DC培养上清中IL - 1 2含量几乎没有差别 ,反而肝癌患者DC培养上清中TNF水平高于健康人。结论 :肝癌患者自身的DC仍具有一定的抗原呈递能力 ,适当调控有可能使其行使APC功能 。

树突状细胞体内外对肝癌细胞的抑制作用

目的:研究树突状细胞对肝癌等肿瘤细胞的直接作用方法:用rhGM-CSF和rhIL-4从健康人外周血诱导树突状细胞,用ELISA和MTT法分别检测DC培养上清液中IL-12和TNF水平,用MTT法检测DC对肝癌细胞SMMC-7721、QGY-7703、HEPG-2、Alexander,胃癌细胞SGC-7901,慢性髓原性白血病细胞K562、Burkitt’s淋巴瘤细胞Raji和正常人二倍体细胞的抑制作用,同时用流式细胞术检测DC表面FasL的表达,最后用DC进行人肝癌裸鼠皮下抑制瘤的抑制试验。结果:诱导7d的DC对4种肝癌细胞和胃癌细胞均有不同程度抑制作用,随着效靶比的增加,DC对肝癌细胞和胃癌细胞的抑制作用逐渐增加;DC预防人肝癌裸鼠皮下移植瘤,其抑制率为97％。结论:DC进入机体后也可以非特异性抑制方式发挥抑癌作用,本研究丰富和拓展了肝癌DC疫苗的内容,为今后肝癌DC疫苗的研究奠定了基础。

CCR7:肿瘤治疗及疗效评价中的新靶点

趋化因子受体7(CC chemokine receptor 7,CCR7),主要表达于树突状细胞、淋巴细胞和各种肿瘤细胞表面,在树突状细胞抗肿瘤免疫应答和促进肿瘤侵袭和淋巴转移过程中发挥着不容忽视的作用。一方面,CCR7使活化的成熟DC通过输入淋巴管进入淋巴结,引导负载抗原的(dendritic cell,DC)从肿瘤部位迁移至淋巴组织,在诱导DC的抗肿瘤免疫反应中起重要作用;另一方面,CCR7在多种肿瘤如乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、胃癌等中表达,而淋巴结中丰富的CCL21则能趋化CCR7阳性的肿瘤细胞向淋巴结转移,直接导致肿瘤的扩散。CCR7在免疫细胞和肿瘤细胞共同表达的这一特点决定了其很有可能成为DC疫苗免疫效果和DC功能评价,以及某些实体瘤淋巴结转移评价乃至治疗的新靶点。

肝癌DC疫苗活化的CTL对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用

目的:本研究探讨肝癌DC疫苗活化的CTL对人肝癌裸鼠皮下抑制瘤的抑制作用。方法:将负载肝癌相关抗原DC经BCG HSP70活化后制成肝癌DC疫苗,用此肝癌DC疫苗诱导的肝癌特异性淋巴细胞预防和治疗人肝癌裸鼠皮下移植瘤,同时观察DC对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的直接预防作用和冷冻复苏后肝癌特异性淋巴细胞对人肝癌裸鼠皮下移植瘤的预防和治疗作用。结果:DC对肝癌细胞的抑制率为97％,用冷冻复苏后的CTL预防人肝癌裸鼠皮下移植瘤,对肝癌细胞的平均抑制率为96％;冷冻复苏后的CTL治疗人肝癌裸鼠皮下移植瘤,对肝癌细胞的抑制率为98％。结论;本研究结果为肝癌DC疫苗的进一步深入研究及今后的临床应用奠定良好的基础。