利用N-端融合(His)_6标签观察家蚕核型多角体病毒泛素蛋白的亚细胞定位

为了给家蚕核型多角体病毒(BmNPV)泛素蛋白(UB)的功能研究提供亚细胞定位信息,利用Red重组系统和BmN-PV的bacmid系统,进行2次同源重组,成功地将(His)6标签编码序列引入到BmNPV泛素基因(ub)起始密码子ATG和第2个密码子CAA之间,使得表达的BmNPV UB的N-端融合(His)6标签。通过对(His)6的免疫荧光分析观察到BmNPV UB在BmN细胞中呈现3种方式的亚细胞定位:均匀地分布于整个细胞;主要分布于细胞核;分布于细胞核,同时在细胞质中出现零星的点分布。BmNPV UB具有多种不同的亚细胞定位方式,提示其功能的多样性。

杆状病毒泛素蛋白的序列及分子进化分析

[目的]分析杆状病毒泛素蛋白的序列特征和分子进化。[方法]运用Clustal W软件进行序列多重联配分析,采用临近法(NJ)和最大简约法(MP)构建系统进化树。[结果]昆虫杆状病毒泛素与真核生物泛素的一致性为73%～86%,差异体现在氨基酸15～32和53～57的序列上,其他序列高度保守。在真核生物泛素蛋白序列中,许多功能性的氨基酸残基在昆虫杆状病毒泛素蛋白序列中也存在。系统进化分析将昆虫杆状病毒和真核生物泛素蛋白大致分为3个亚家族,即GV族、Ⅰ族和Ⅱ族。杆状病毒泛素基因采取负选择的进化方式,在长期进化过程中,其氨基酸序列倾向于逐渐被固定下来,达功能和结构上的稳定。[结论]分析杆状病毒泛素的序列特征和分子进化,为进一步研究其生物学功能提供参考。

核型多角体病毒多角体作为微晶的研究进展

核型多角体病毒产生的多角体是一种蛋白质晶体,主要由包埋型病毒粒子(occulusion derived virus,ODV)和多角体蛋白(polyhedrin,Polh)组成。利用杆状病毒表达系统将外源蛋白表达并包埋到多角体中,制备含有外源蛋白的多角体微晶,是近几年引人关注的课题。本文综述了核型多角体病毒多角体这方面的研究成果,并展望其应用开发前景。

家蚕核型多角体病毒泛素蛋白单克隆抗体的制备

泛素(ubiquitin,UB)是一种小分子质量蛋白。从氨基酸序列上看,杆状病毒UB与真核生物UB的差异体现在2段序列上,即第15~31个和第53~57个氨基酸,其余的序列高度保守。这种高度保守性使得许多商业化的抗泛素抗体难以特异地将二者区分开来。将人工合成的家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)UB(v-UB)多肽17TEPAETVADLKQ28作为免疫原免疫BALB/c小鼠,成功制备了针对该多肽的特异性单克隆抗体,实现了对v-UB的特异性检测。利用该抗体,确定v-UB在细胞质中形成的斑点状结构为P62内涵体(inclusion body)。获得的单克隆抗体为今后v-UB的研究提供了实验基础。

杆状病毒泛素蛋白的序列及分子进化分析(英文)

[目的]分析杆状病毒泛素蛋白的序列特征和分子进化。[方法]运用ClustalW软件进行序列多重联配分析,采用临近法(NJ)和最大简约法(MP)构建系统进化树。[结果]昆虫杆状病毒泛素与真核生物泛素的一致性为73%～86%,差异体现在氨基酸15～32和53～57的序列上,其他序列高度保守。在真核生物泛素蛋白序列中,许多功能性的氨基酸残基在昆虫杆状病毒泛素蛋白序列中也存在。系统进化分析将昆虫杆状病毒和真核生物泛素蛋白大致分为3个亚家族,即GV族、I族和II族。杆状病毒泛素基因采取负选择的进化方式,在长期的进化过程中,其氨基酸序列倾向于逐渐被固定下来,达功能和结构上的稳定。[结论]分析杆状病毒泛素的序列特征和分子进化,为进一步研究其生物学功能提供参考。

家蚕自噬受体蛋白Bmp62与Bmref(2)P形成聚集体的研究

p62聚集体在自噬体形成和抗氧化应激过程中起着十分重要的作用。人源p62通过PB1结构域自我寡聚。家蚕基因组只含有一个p62基因。该基因表达两个蛋白,即Bmp62和Bmref(2)P。Bmref(2)P比Bmp62缺少PB1结构域。在家蚕细胞中瞬时表达Bmp62和Bmref(2)P,发现Bmp62和Bmref(2)P在细胞质中共定位且形成聚集体。为研究Bmp62和Bmref(2)P各结构域在聚集体形成中的作用,构建Bmp62和Bmref(2)P的缺失突变体并与eGFP融合表达,发现缺失氨基酸残基1—101的Bmref(2)P在细胞质中弥散分布且不能形成聚集体,而含有PB1的Bmp62缺失突变体都能在细胞质中形成聚集体。对p62同源蛋白的结构域进行分析发现,部分p62不含有PB1结构域。

分子伴侣系统HSC/HSP70促进家蚕核型多角体病毒的增殖

作为分子伴侣系统之一,HSC/HSP70在细胞许多生理生化通路中起着十分重要的作用。杆状病毒的感染诱导宿主细胞HSC/HSP70的表达,但对HSC/HSP70在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)生命周期中的作用的研究仍较少。利用特异性染料,本研究发现BmNPV表达的多种蛋白质在细胞质中形成聚集体。运用槲皮苷抑制HSC/HSP70表达后,BmNPV基因组复制、多角体蛋白表达量以及子代芽生病毒和多角体产量都显著降低。这些结果表明HSC/HSP70对BmNPV的增殖起着非常重要的作用。

COX-2、NF-κB、WT-1、PTEN在恶性腹膜间皮瘤中的表达及与预后的关系

目的研究恶性腹膜间皮瘤组织中环氧合酶-2(COX-2)、核因子-κB(NF-κB)、Wilm’s瘤基因-1(WT-1)、PTEN的表达及与预后的关系。方法选取2011—2013年经病理确诊的恶性腹膜间皮瘤33例,应用免疫组织化学SP法检测病变腹膜组织中COX-2、NF-κB、WT-1及PTEN的表达,并分析与年龄、性别、血小板升高、石棉接触、CA125升高、腹水、淋巴结转移、临床分期等指标的关系。对所有患者进行随访,分析标志物与预后的关系。结果 33例恶性腹膜间皮瘤中,COX-2、NF-κB、WT-1及PTEN的阳性表达率分别为63.64%、51.52%、72.73%和21.21%。4项指标与年龄、性别、血小板升高、石棉接触、CA125升高、腹水、淋巴结转移、临床分期均无相关性(P>0.05)。COX-2和NF-κB分别与PTEN呈负相关。单因素和多因素生存分析显示,PTEN阴性表达患者生存时间短,而COX-2与NF-κB阳性表达患者生存时间短。PTEN是影响恶性腹膜间皮瘤预后的独立风险因素。结论高表达COX-2及NF-κB提示预后不良,PTEN是影响恶性腹膜间皮瘤的独立预后因素。

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。

棉铃虫核型多角体病毒ORF33基因的原核表达和在宿主细胞中亚细胞定位(英文)

对棉铃虫Helicoverpa ar migera核型多角体病毒HearSNPV的ORF33基因(ha33)进行克隆和原核表达,hass在E.coli中表达不完全,表达产物的大小为17kDa,小于预测的分子量28.4kDa。用纯化的原核表达产物免疫家兔,制备了多克隆抗体,应用多克隆抗体检测了HearSNPV感染的宿主细胞(HzAMI)中ORF33基因的表达,表达产物的分子量为31kDa。并通过共聚焦荧光显微镜方法,用多克隆抗体检测编码的蛋白在宿主细胞(HzAM1)中的亚细胞定位,发现ha33编码的蛋白存在于宿主细胞的细胞质中,并持续到感染后期。

恶性腹膜间皮瘤患者预后影响因素研究

目的探讨恶性腹膜间皮瘤(MPeM)组织病理学特点及常用临床指标对预后的影响。方法选取沧州市中心医院2012—2015年收治的首次确诊的72例MPeM患者,分析性别、年龄、体质指数(BMI)、病理分型、TNM分期、美国东部肿瘤协作组体能状况(ECOG)评分、Charlson合并症指数(CCI)及腹膜癌病指数(PCI)及其对预后的影响。结果 MPeM患者的临床特征缺乏特异性,以腹胀为主要临床表现,其次为腹痛。TNM分期:Ⅰ~Ⅱ期52例,Ⅲ~Ⅳ期20例。病理大体分型:弥漫型68例,局限型4例。病理组织学分型:上皮型69例,肉瘤型3例。42例接受了腹腔化疗。不同组织学分型、TNM分期、ECOG评分、PCI及化疗情况患者累积生存曲线比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Cox回归模型分析显示,TNM分期(HR=2.105,P=0.015)、ECOG评分(HR=1.930,P=0.038)、化疗(HR=0.457,P=0.005)是MPeM患者预后的独立影响因素。结论 MPeM疾病分期越早、患者体能状态越好,对预后越有利,早期检查及诊断对提高生存率有重要意义。

梗阻性黄疸患者血清TSGF和CA19-9水平与其预后的相关性研究

目的探讨肿瘤特异性生长因子(TSGF)和糖类肿瘤相关抗原(CA19-9)对梗阻性黄疸(obstructive jaundice,OJ)患者预后的影响。方法检测OJ患者和健康对照组血清TSGF和CA 19-9水平,采用t检验、x2检验等比较组间差异,分析其水平对患者预后的影响。结果 OJ患者TB、ALT、AST水平均明显高于对照组(P<0.05),且肿瘤性OJ与良性OJ间TB、ALT、AST水平均存在统计学差异(P<0.05);治疗后,肿瘤性OJ组的TB、ALT、AST水平较治疗前明显降低,但仍高于对照组(P<0.05);ALB变化与TB、ALT、AST相反。肿瘤性OJ组TSGF及CA 19-9阳性率均明显高于良性OJ组和对照组,良性OJ组TSGF及CA19-9阳性率均明显高于对照组(P<0.05)。阳性TSGF和CA 19-9均可使患者预后变差,二者均为阳性的患者3年累计生存率最低(P<0.05)。结论应重视梗阻性黄疸,及早进行规范治疗;如有条件推荐检测TSGF和CA 19-9水平,并采取措施阻止病情恶化,尽可能改善预后。

嗜虫书虱磷化氢敏感品系和抗性品系在不同磷化氢浓度下的种群灭绝时间研究

研究嗜虫书虱磷化氢敏感品系QLe - 3和抗性品系GLZLe - 1在 2 5℃、75 %RH条件、不同磷化氢浓度下的种群灭绝时间 ,结果表明 :在 10 0mL/m3、2 0 0mL/m3、4 0 0mL/m3、70 0mL/m3的磷化氢浓度时 ,抗性品系的种群灭绝时间分别为 13天、10天、7天、6天 ;在5 0mL/m3、10 0mL/m3、2 0 0mL/m3、4 0 0mL/m3、70 0mL/m3的磷化氢浓度下 ,敏感品系的种群灭绝时间分别为 6天、4天、3天、2天、2天。嗜虫书虱的卵不论是抗性还是敏感品系 ,对PH3的耐药性都强于成虫和若虫 ;用磷化氢熏蒸时 ,嗜虫书虱的卵孵化推迟 3～ 6天 ,增加了防治难度 ;磷化氢浓度和种群灭绝时间之间的关系可用CnT =K式表示 ,敏感品系QLe - 3的关系式为C0 .4 4TPE =4 2 .0 5 (mg·h/L) ,抗性品系GLZLe - 1为C0 .4 1TPE =138.5 5 (mg·h/L)。

GS环保试剂在病理制片中的应用体会

甲醛、二甲苯、氧化汞应用于病理常规制片技术至今已100多年，虽方法成熟，但不环保。我院于2011年应用GS组织样本制备及切片染色套液对3000余例外科活检标本进行批量实验，制片结果与传统方法基本一致，是一套能替代传统试剂的环保型试剂。

不同的恒定PH_3浓度下嗜虫书虱抗性品系的种群灭绝时间

在(25±1)℃、75%±5%RH条件下,利用连续通气熏蒸仪器测定了嗜虫书虱敏感的参考品系QLe-3和PH3抗性品系GLZLe-1在不同的恒定PH3浓度下的种群灭绝时间(timetopopulationextinction,简称TPE),在50、100、200、400和700mL/m3的浓度下,参考品系QLe-3的TPE分别为6、4、3、2、2d.由于50mL/m3对GLZLe-1品系为无效浓度,无法测得TPE,除此之外GLZLe-1的TPE分别为13、10、7、6d.恒定的PH3浓度和TPE之间的关系可用Cn·t=k式表示,参考品系QLe-3的关系式为C0.44·TPE=42.05(mg/L)n·h,抗性品系GLZLe-1为C0.41·TPE=138.55(mg/L)n·h.两品系的卵对PH3的耐药性都强于成虫和若虫.上述结果表明,采用PH3熏蒸防治抗性储粮书虱的实践中,推荐的最低有效浓度应为100mL/m3,熏蒸时间大于13d.

TSGF和CA19—9在大鼠梗阻性黄疸模型肝组织中的表达及意义

目的探讨肿瘤特异性生长因子（TSGF）和糖类肿瘤相关抗原（CA19—9）在大鼠梗阻性黄疽模型肝组织中的表达及意义。方法采用快速检测试剂盒检测模型组和对照组（各30只大鼠）肝脏组织中的TSGF和CA19．9表达水平，用t检验、关联性分析等比较组间差异，分析其生物学意义。结果模型组大鼠各时间点TB、ALT、AST等指标均明显高于对照组（P〈0．05），ALB明显低于对照组（P〈0．05）；模型组术TSGF、CA19—9水平均明显高于对照组（P〈0．05），且随手术时间延长而升高（R=0．970，P=0．006；R=0．987，P=0．006）；TSGF及CA19．9与TB呈较强的正相关关系（R=0．9196，R=0．7808），TSGF及CA19．9与ALB呈较强的负相关关系（R-0．8494，R-0．7024，P〈0．05）。结论梗阻性黄疸大鼠模型的肝脏功能损伤越严重，TSGF、CA19．9水平越高，提示肿瘤越有可能存在，对于梗阻性黄疸患者应及早进行治疗，以避免病情恶化。

高校辅导员的思想政治教育对大学生生涯规划的作用

大学生生涯规划工作纳入高校思想政治教育工作体系已经迫在眉睫,高校辅导员在学生思想政治教育工作中充当了特殊角色,决定了在大学生生涯规划的辅导教育中辅导员的重要作用。本文论述了辅导员的思想政治教育在大学生生涯规划中如何发挥作用。

家蚕核型多角体病毒orf90基因在Bac-to-Bac家蚕杆状病毒系统中快速表达

【目的】利用BmNPV的Bac-to-Bac系统快速表达目的基因orf90,为深入研究该基因打下基础。【方法】将目的基因BmNPVorf90克隆到转移载体pFasBacHTb上,并将报告基因egfp插入到orf90的3'末端,形成重组转移载体pFasBacHTb-egfp-90。在将其转化到含穿梭载体bacmid的感受态细胞DH10Bac中,通过转座作用,经白斑筛选得到重组穿梭载体。纯化DNA,用脂质体介导转染家蚕BmN细胞,得到重组病毒bacmid-egfp-90。【结果】转染细胞72h后在荧光显微镜下可以观察到强烈的绿色荧光。重组病毒穿刺接种家蚕蛹,5d后观察到很强的荧光。结果表明构建的Bac-to-Bac系统能在家蚕细胞和蛹体中正确的快速表达外源基因。【结论】证明BmNPV的Bac-to-Bac是一个快速表达系统,适合在家蚕上广泛应用。

干熄焦大砌块技术的应用与实践

为延长干熄炉的使用寿命,缩短干熄炉维修周期,利用大砌块技术对干熄炉炉口部位、内环墙部位、斜道区耐材部门进行施工改造,改造后干熄炉工作层的耐材寿命有了很大的改善和提升。摸索了工业窑炉中大砌块技术的特点和材料性能,为干熄炉的维修维护提供了宝贵的经验。

胆汁内外引流术对梗阻性黄疸大鼠肝脏TSGF和CA19-9表达的影响

目的探讨胆汁内外引流术对梗阻性黄疸（OJ）大鼠肝脏肿瘤特异性生长因子（TSGF）和糖类肿瘤相关抗原（CA 19-9）表达的影响。方法采用改良方法制备OJ、胆汁内引流组（ID）、胆汁外引流组（ED）和假手术组（SH）共120RSD大鼠模型，采用快速检测试剂盒检测大鼠肝脏TSGF和CA19-9水平，采用t检验、关联性分析等比较组间差异及其生物学意义。结果SH组的TB、ALT、AST水平最低，ID次之，ED及OJ组的TB、ALT、AST水平均高于SH、ID组，差异均有统计学意义（P〈0．05）；SH组的ALB最高，ID次之，ED组再次，OJ组最低（P〈0．05）；SH组的TSGF及CA19．9水平最低，ID次之，ED及OJ组最高，差异均有统计学意义（P〈0．05）；TSGF及CA19-9与TB呈正相关关系，与ALB呈负相关关系（P〈0．05）。结论胆汁内外引流术可有效缓解梗阻性黄疸大鼠的胆汁淤积状况，明显改善大鼠的肝功能．降低由此诱发的肿瘤危险性；相同的条件下，胆汁内引流效果更佳。