非洲猪瘟病毒防污染双重荧光定量PCR检测方法的建立

荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术在非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测中发挥重要作用,然而该方法也存在一些局限性。一方面由于检测环境中易产生气溶胶污染,经常导致qPCR检测产生假阳性结果。另一方面,临床上已发现MGF基因缺失的变异株,现有的检测方法将无法满足野毒株与变异株鉴别检测的需求。为了解决qPCR易产生假阳性,ASFV核酸检测靶标基因过分单一的问题,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。该检测方法根据C962R基因和MGF-505-2R基因的保守序列设计引物和探针,并在反应体系中加入UNG酶达到防污染的目的,建立了ASFV的防污染双重qPCR检测方法。结果表明,利用该方法对C962R基因和MGF-505-2R的基因标准品进行检测,该检测方法具有较好的鉴别诊断效果。该检测方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.99;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL的ASFV基因标准品;特异性强,与猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(Hoemophilus parasuis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)及猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)均无交叉反应;重复性较好,变异系数小于1.75%,使用该检测方法对194份临床组织样品检测,与商品化非洲猪瘟病毒抗原检测试剂盒比较,检测结果均为阴性,符合率为100%。该方法预期可用于ASFV野毒株与MGF-505-2R基因缺失株的鉴别诊断,为深入开展分子流行病学调查提供技术储备。

鳄蜥源葡萄牙柠檬酸杆菌和摩氏摩根菌的分离鉴定及药敏分析

为确定2021年7月广西大桂山鳄蜥国家级自然保护区北娄管理站患病鳄蜥(Shinisaurus crocodilurus)的病原体及病原特征,从鳄蜥尸体肺和肝中分别分离得到1株细菌,通过形态学观察、生理生化试验、分子生物学鉴定、药敏试验和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)方法分析,确定肺中的分离菌株BL1682F为葡萄牙柠檬酸杆菌(Citrobacter portucalensis),肝中的分离菌株BL1682G为摩氏摩根菌(Morganella morganii)。药敏试验结果表明:分离菌株BL1682F对庆大霉素、阿米卡星、头孢呋辛、头孢吡肟、环丙沙星、磺胺甲唑、氨曲南和四环素敏感,对氨苄西林耐药;分离菌株BL1682G对庆大霉素、哌拉西林、头孢曲松、头孢吡肟、磺胺甲唑和氨曲南敏感,对头孢呋辛和四环素耐药。多位点序列分型结果鉴定分离菌株BL1682F为新的序列型(sequence type,ST),与标准菌株ST-4和ST-267亲缘关系最近。研究结果可为鳄蜥疾病的预防和分子流行病学的研究提供参考。

非洲猪瘟病毒蛋白功能研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的猪的高度接触性传染病。ASFV编码的蛋白超过200个,pp220、pp62、p10、p12、p14.5、p17、p22、p30、p49、p54、p72、CD2v、pE248R、pM1249L、pH240R和j5R是病毒的组装和形成的主要结构蛋白,其中CD2v、p12、p30和p54是ASFV的重要毒力蛋白;已知的非结构蛋白有DP71L、A238L、9GL、pE296R、Ep152R、L38L、DP9GR、A179L、pI215L和PE165R,这些蛋白是ASFV干扰宿主细胞正常代谢和免疫逃避的关键因素。对ASFV蛋白功能的深入了解有助于研究ASFV的致病机制及防控方法。

思想品德课程整合管见

随着新一轮课程改革的深入推进，全国各地“课堂建模推模”活动如火如茶地进行着，各级各类“课博会”“研教会”“报告会”也热火朝天地开展着。我们认为，课堂教学模式改革的实质是教学方法的改革，只是“教改”，并不是“课改”的全部。

副猪嗜血杆菌sapA基因克隆与生物信息学分析

试验旨在克隆副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)sapA基因,并对其进行生物信息学分析,以期为sapA基因缺失疫苗的开发与应用提供理论依据。以71株临床菌株为研究对象,经PCR扩增鉴定其中的阳性菌株;将扩增得到的sapA基因片段与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后进行测序;用生物信息学软件进行核苷酸与氨基酸序列比对、系统进化树分析、蛋白二级和三级结构预测、疏水性预测、柔性区域位预测、B细胞抗原表位预测和Jameson-Wolf抗原指数预测。试验结果显示,在71株临床菌株中,有29株成功扩增出sapA基因,29株Hps的sapA基因核苷酸序列与已公布的SH0165菌株相似性为96.5%~98.8%,除H88菌株外,氨基酸序列与SH0165菌株相似性为98.9%~100%。sapA蛋白二级结构主要有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,有13个亲水区、38个柔性区和23个B细胞潜在抗原表位。以上结果表明,Hps的sapA基因是一个保守基因,各菌株间核苷酸序列、氨基酸序列都有很高的相似性,sapA蛋白具有较强的抗原性。

伪狂犬病病毒野毒株新型可视化环介导等温扩增检测方法的建立

利用环介导等温扩增(LAMP)与pH指示剂结合的方式建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的快速检测方法,并优化反应体系。结果显示,该方法特异性良好、敏感性较高,检测限达100.5TCID50,与荧光定量PCR的敏感性一致。对52份临床样品进行检测,用荧光定量PCR检测出30份阳性样品,LAMP检测出27份阳性样品,二者的符合率为94.2%。结果表明,PRV野毒株新型可视化LAMP检测方法操作简便、结果判别明显、检测成本低,可预期应用于PRV带毒猪的快速筛查,这对于猪伪狂犬病的净化具有重要意义。

基于CHO-K1细胞稳定表达的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA检测方法,将构建的GFP基因与CD2v基因串联的重组真核表达质粒pIRES-GFP-CD2v转染CHO-K1细胞,通过嘌呤霉素筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达CD2v的单细胞克隆株。转染细胞经过PCR鉴定后进行扩大培养,收集并纯化细胞培养液,获得目的蛋白,通过Western-blot验证其反应原性。结果表明,ASFV CD2v蛋白在CHO-K1细胞中被成功表达,并能与ASFV抗体阳性血清反应。以纯化的GFP-CD2v重组蛋白为包被抗原建立检测ASFV CD2v蛋白抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原最佳包被质量浓度为1.25μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶100,酶标抗体最佳稀释度为1∶50000,以此建立的ASFVCD2v蛋白的间接ELISA方法临界值为0.31;该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒等病毒抗体阳性血清均无交叉反应,表明该方法的特异性较强;用该ELISA方法检测阳性血清敏感性可达1∶1600;批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本试验中建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV抗体的检测。

思想品德课程整合之管见

随着新一轮课程改革的深入推进，全国各地“课堂建模推模”活动如火如荼地进行着，各级各类“课博会”“研教会”“报告会”也热火朝天地开展着。当别人为取得“课堂真经”而兴奋不已时，我们却在反思着“课改窄化”的问题。课堂教学模式改革的实质是教学方法的改革，

非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。

救护鳄蜥食物有害重金属和农药残留的检测

鳄蜥(Shinisaurus crocodilurus)为国家I级保护野生动物。近年来,我国广西大桂山鳄蜥国家级自然保护区北娄繁育基地救护的鳄蜥一直存在疾病困扰,但原因不明。为了探讨这些疾病的发生是否与其食物中的重金属及农药污染相关,本研究采用电感耦合等离子体质谱和色谱质谱分析技术来检测其主要食物中的重金属和农药残留含量。结果显示,与其食物(蚯蚓)相比,鳄蜥体内的重金属含量更低,同时,农药残留含量在鳄蜥及其食物中均未检测出,说明重金属和农药通过食物的生物放大作用而在鳄蜥体内累积的可能性较小。因此,重金属与农药这两类环境污染物对鳄蜥疾病发生的影响较小。本研究为鳄蜥的人工救护繁育工作提供一定的参考,有利于鳄蜥的保护工作。