应用NPCR发现我国Kawasaki型恙虫病立克次体

本文报告用恙虫病立克次体表面蛋白５６ＫＤａ型特异抗原（ｔｓａ５６ＫＤａ）基因编码区的引物，采用嵌合式聚合酶链反应（ＮＰＣＲ）鉴定江苏地区的２株恙虫病立克次体。结果该２株恙虫病立克次体与Ｇｉｌｌｉａｍ，Ｋａｒｐ，Ｋａｔｏ和Ｋｕｒｏｋｉ型特异引物无任何ＤＮＡ扩增带，而与日本ｋａｗａｓａｋｉ株型特异引物扩增后有５２３ｂｐ的ＤＮＡ扩增带，表明我国存在Ｋａｗａｓａｋｉ型恙虫病立克次体。

聚合酶链反应用于恙虫病立克次体检测和分型的研究

本文报道聚合酶结反应用于恙虫病立克次体（Rt）检测和分型研究结果，以构建的Rt外膜主要蛋白56kDa型特异抗原（tsa56kDa）基因编码区的群、型特异引物，采用1步法PCR分别对Gilliam，Karp，Kato，Kawasaki和Kuroki5株标准株Rt，江苏地区5份Rt阳性标本，斑点热和莫氏立次体以及5份正常输血员全血标本进行检测和分型。研究结果证明所构建的Rt群、型引物具有Rt的特异性，型特异引物在Rt的型与型之间无交叉扩增。因此，该研究对恙虫病的诊断、流行病学调查以及Rt的型别鉴定具有实用价值。通过对江苏省东台、海安、南京地区5株Rt的型别鉴定，再次证明江苏地区Rt流行株为我国首次从分子水平发现的一个新型Rt．而且是江苏地区流行的主要优势株，与日本Kawasaki型相似。在调查中未发现其它株型。

恙虫病立克次体弱毒株分离方法的研究

江苏省于1986年发现秋冬型恙虫病的流行,并从病原学和血清学得到证实。但用病人、鼠、螨标本接种小白鼠,鼠的症状和病变不明显,且难以检出恙虫病立克次体。1990年以来,我们在分离恙虫病立克次体方法上作了以下改进:多次用环磷酰胺和稀释液处理接种标本的小白鼠;增加稀释液的成分;把握好小白鼠的传代时机等。结果从病人外周血、鼠和小盾纤恙螨中均分离到恙虫病立克次体,说明该方法对分离恙虫病立克次体弱毒株是有效的。

用PCR检测现场单个小盾纤恙螨体内恙虫病立克次体的研究

恙虫病立克次体（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ，Ｒ．ｔ）表面蛋白５６ＫＤａ（ｔｓａ５６ＫＤａ）基因编码区构建的群特异引物，采用嵌合式聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＮＰＣＲ）检测现场捕获的单个小盾纤恙螨幼虫体内Ｒ．ｔ的ＤＮＡ。共检测江苏省恙虫病疫区小盾纤恙螨幼虫６１只，结果２只幼虫提取的ＤＮＡ经扩增后见４８１～５０７ｂｐ的ＤＮＡ扩增带，表明这２只幼虫携带有Ｒ．ｔ，其该种螨Ｒ．ｔ携带率为３．２７％。证明该法可用于单个恙螨幼虫体内Ｒ．ｔ的检测，对恙虫病疫区媒介恙螨的流行病学调查具有实用价值。

我国新型恙虫病立克次体目标基因的PCR/RFLR和序列分析研究

为查明江苏恙虫病立克次体（Ｒｔ）流行株目标基因序列特征，构建Ｒｔｔｓａ５６ｋＤａ群、型特异引物，用ＰＣＲ技术进行检测、分型，将群引物扩增产物进行ＲＦＬＰ分析和热循环自动双向测序法进序列测定。结果所构建的Ｒｔｔｓａ５６ｋＤａ的群、型引物具有Ｒｔ的特异性；江苏地区Ｒｔ流行株型别与日本Ｋａｗａｓａｋｉ型相似；群引物扩增产物经ＲＦＬＰ分析，证明该片段ＤＮＡ无ＨｈａⅠ酶切位点；碱基序列测定结果与Ｋａｗａｓａｋｉ型相应ＤＮＡ片段的碱基序列同源性为９６．８７％，而与其它５株Ｒｔ同源性均少于５２％；该片段的ＨｈａⅠ酶切位点ＧＣＧＣ变异为ＧＴＧＣ结构。结果表明江苏地区Ｒｔ株型属于日本Ｋａｗａｓａｋｉ型，但有遗传差异。

PCR/RFLP用于恙虫病立克次体基因分析的研究

为查明江苏地区恙虫病立克次体（Ｒｔ）型别及目的基因序列差异性。本室构建Ｒｔ外膜主要蛋白型特异抗原５６ｋＤ的群、型引物进行ＰＣＲ分型。选用ＳｎａＢＩ，ＨｈａＩ和ＢｇｌⅡ限制性核苷酸内切酶切割ＰＣＲ产物（ＰＣＲ／ＲＦＬＰ）方法，对江苏地区的５份Ｒｔ目的基因分析研究与Ｇｉｌｉａｍ，Ｋａｒｐ，Ｋａｔｏ，Ｋａｗａｓａｋｉ和Ｋｕｒｏｋｉ标准参照株Ｒｔ比较，结果证明江苏地区Ｒｔ型别与日本Ｋａｗａｓａｋｉ型相似，但缺乏ＨｈａＩ的酶切位点。

国外恙虫病立克次体研究进展

1975年日本发现流行株与古典型不同的新型恙虫病立克次体[Rickettsia tsutsugamushi,Rt]。新型Rt主要流行于秋冬,对小白鼠致病力弱或不致病,从而给分离病原带来难度。Kabayashi 采用 Tachibana 建立的CPA处理小白鼠后分离立克次体的方法,成功地从病人外周血中分离到弱毒株Rt,促进了弱毒株Rt的研究。本文对近几年Rt研究情况作一综述。

从大麝鼩分离到恙虫病立克次体

1986年前,恙虫病在我国仅发现于浙江以南,属夏季型;1986年,我们在江苏发现秋冬型恙虫病的流行。为查明恙虫病在江苏的流行环节、特点和流行因素等,我们进行了系统调查研究。1990年10月从东台市安丰乡捕获的大麝鼩(Crocidura lasiura)中分离到2 株恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi,Rt.),现报道如下。

诊断梅毒的三种过筛试验的原理及应用

诊断梅毒应有病史、临床症状及实验室检查结果综合分析才能确诊。血清学试验是诊断梅毒的主要手段之一。目前WHO推荐诊断梅毒的血清学方法用于过筛的试验有:(1)性病研究室试验(Veneral Disease Research Laboratory——VDRL)。(2)不加热(灭能)

检测恙螨幼虫体内恙虫病东方体DNA用于监测恙虫病流行病学分析

目的 了解恙螨幼虫体内恙虫病东方体自然感染率与恙虫病流行的关系 ,为恙虫病的监测与防治提供理论依据。方法 1974～ 1982年福建省 49个点捕获的野鼠体表采集恙螨幼虫 910 93只 ,同种为一组用乙醇保存 ,以 10～ 5 0只为一份 ,用东方体 5 6 k Da基因所构进的引物进行 PCR扩增。将结果与 90年代捕获的恙螨幼虫 PCR检测结果比较 ,结合相应年代的恙虫病发病情况进行分析。结果 1974～ 1981年捕获地里纤恙螨 2 9份、小板纤恙螨 9份 ,高湖纤恙螨 3份、苍白纤恙螨 12份、于氏纤恙螨 1份、中华无前纤恙螨 1份 ,PCR检测恙螨幼虫体内东方体 DNA均为阴性。1982年 12月采集的小板纤恙螨 1份 ,1991年 6 - 7月采集的地里纤恙螨 1份 ,检测到东方体 DNA。结果表明 1982年前恙螨幼虫体内东方体自然感染率极低。结论 恙螨幼虫体内东方体的自然感染率高低与恙虫病流行有密切关系。

猪链球菌2型谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的克隆表达猪链球菌谷氨酸脱氢酶(GDH),并测定其酶活性。方法设计引物采用PCR法自海安病人分离株Habb基因组扩增GDH的编码基因gdh,进行序列分析;构建重组表达质粒pGEX4T-2-gdh,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测;通过亲和层析纯化,获得融合蛋白GST-GDH,用凝血酶剪切去除GST,获得完整的GDH纯化蛋白后测定其酶活性。结果PCR法自猪链球菌菌株Habb基因组扩增出约1.3kb的目的片段;序列分析显示猪链球菌的GDH具有GDH蛋白家族I的典型保守序列;体外构建筛选原核表达质粒pGEX4T-2-gdh,诱导重组体,表达的蛋白经PAGE初步测定其相对分子质量(Mr)约为71×103;用凝血酶酶切去除融合蛋白中的GST标签后得到的蛋白相对分子质量为45×103;GDH活性测定显示猪链球菌GDH利用α-酮戊二酸做底物,用NADPH做辅酶催化氨的同化和谷氨酸的合成。结论克隆并表达出猪链球菌GDH;猪链球菌GDH属于GDH蛋白家族I,是NADP(H)-特异性GDH。

安徽三界地区啮齿动物感染恙虫病东方体调查

目的调查安徽三界地区啮齿动物自然感染恙虫病东方体分离株,并确定其基因型别。方法流行季节在野外用鼠笼捕鼠并鉴定鼠种、携螨率;巢式PCR对鼠脏器进行恙虫病东方体56 kD基因片段检测;将鼠脏器接种小白鼠进行病原体分离,PCR扩增分离株Ot 56 kD基因片段,并将目的片段进行测序,基因序列同源性及进化分析。结果捕获啮齿动物数及其携螨率,黑线姬鼠60%(15/25);褐家鼠45.5%(5/11);东方田鼠和鼩鼱各2只,均阴性。40只野鼠脏器有3只恙虫病东方体PCR扩增阳性,阳性率为7.5%;从黑线姬鼠标本中分离到1株恙虫病东方体Sanjie,56 kD基因片段测定该株与台湾TT0711a和NT0511b分离株同源性最高(98%),系统发生树分析也显示与Kawasaki型共处于同一分支。结论安徽三界地区存在鼠类恙虫病东方体自然感染,黑线姬鼠为其主要宿主,当地恙虫病东方体属Kawasaki基因型。

猪链球菌引起人中毒性休克综合征和脑膜脑炎的流行病学调查及病原学研究

目的 本研究拟查明 1998年华东地区一种与病死猪有接触史的人的急性传染病病原体的生物学特征与疾病流行的关系。方法 流行病学调查 ,并对病死猪及死亡患者进行病理检查 ,分离病原及其实验研究。结果 该病具有起病急、病情重、病程短、病死率高等特点。临床及病理表现为 :起病多似感冒有高热、四肢疼痛、有时有呕吐、腹泻等 ,迅速发展为肌炎、筋膜炎、DIC、多脏器功能衰竭、休克 ,多于 2～ 3d内死亡。 2 5例患者中 ,临床表现为中毒性休克综合征的 16例 ,链球菌性脑膜脑炎综合征的 9例 ,两者的病死率分别为 81.2 5 %和 11.11%。从猪和病人标本分离的病原体 ,其形态、染色性、生物学特征均一致。结论 患者血和病猪脏器中分离的病原菌鉴定结果证明两者均为链球菌。

猪链球菌种及其主要致病血清型多重PCR检测方法的建立

根据猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因和血清型1型、2型、1/2型、7型、9型和14型的荚膜多糖编码基因核酸序列,分别设计猪链球菌种和血清型特异性引物,建立并优化多重PCR检测方法,检测分析种属背景明确的73株菌株(其中猪链球菌49株、其他对照菌株24株)及临床分离样本94株(包括四川资阳临床分离样本45株)。其中73株种属背景明确菌株多重PCR种检测结果符合率为87.5%,6种主要致病血清型检出率可达100%。24株对照菌株在种和血清型检测均为阴性。对45株四川猪链球菌病暴发现场分离菌株进行检测,其中41株为猪链球菌2型。上述结果提示建立的多重PCR方法对猪链球菌种及主要致病血清型的检测具有较好的特异性和敏感性,可用于猪链球菌病的快速诊断和流行病学调查。

轮状病毒抗原基因在马铃薯细胞中的表达和活性检测

目的轮状病毒引起的婴幼儿腹泻病在发展中国家有较高的发病率和病死率因此研制安全有效的轮状病毒疫苗成为当务之急。方法本文采用RT-PCR扩增截短VP4蛋白基因,克隆于植物表达载体pBI221,再双酶切pBI221,将带有CaMV35S启动子、外源基因及终止子的片段转入pSB11,通过三亲杂交方法,制备农杆菌转化载体pSB111-VP4,并对pSB111-VP4作点杂交检测,筛选鉴定重组子,并对马铃薯组织细胞进行转化。结果Western印迹检测其免疫活性且具有良好的抗原性。结论该转化系统的建立,为研制轮状病毒重组疫苗、亚单组疫苗、转基因植物口服疫苗做了前期准备。

小盾纤恙螨经卵传递病原体研究

目的 探索快速取得大量小盾纤恙螨未食子代幼虫的方法 ,以适应研究恙螨经卵传递病原体的需要。方法 将小黑板放置在肾综合征出血热 (HFRS)及恙虫病疫区草地上 ,10min后取回计算螨数并鉴定螨种。该法可收集到大量小盾纤恙螨未食子代幼虫。 2 0～ 3 0只幼虫为 1批叮刺 1只小白鼠乳鼠以分离汉坦病毒 (HV)或叮刺 1只小白鼠以分离恙虫病东方体 (Ot)。结果 2 4批恙螨幼虫叮刺乳鼠 ,分离到 5株HV ;6只小白鼠被恙螨幼虫叮刺 ,分离到 2株Ot。试验中所用幼虫未曾叮刺过 ,但鼠被这些幼虫叮刺后能感染上HV和Ot ,表明这些螨所带病原体系由母代螨经卵传递而来。结论 小黑板可采集到疫区草地上大量小盾纤恙螨未食幼虫 ,为研究恙螨经卵传递病原体提供了一种快速、简便、经济的方法。研究结果证明小盾纤恙螨可经卵传递HV和Ot,可作为HFRS和恙虫病的传播媒介。

问号钩端螺旋体检测基因芯片的研制

目的 制备一种用于快速检测、鉴定问号钩端螺旋体的DNA微阵列芯片。方法 从Genbank中选取钩体 2 3SrDNA序列 ,设计一对种特异性引物和DNA探针 ,通过Blast的基因同源性比较 ,验证引物和探针的通用性与特异性。将合成的探针点样到玻片上制备成基因芯片。用Cy3标记引物 ,通过不对称PCR反应获取荧光素标记的靶序列 ,然后与制备的芯片杂交。结果 设计的引物与探针仅同时与问号钩体 2 3srDNA完全同源。该引物可扩增我国 18个血清群的 2 5株钩体 ,均出现单一 4 82bp的扩增产物 ,而双曲钩体及其他螺旋体、病原、空白对照均无任何DNA扩增条带。芯片杂交结果与常规PCR方法结果一致 ,敏感性高于PCR。结论 基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测问号钩端螺旋体。

基因芯片技术检测恙虫病东方体DNA的方法建立

目的 研制用于东方体检测的基因芯片 ,建立快速、灵敏、特异的恙虫病诊断方法。方法 根据东方体 5 6kD外膜蛋白基因序列 ,设计群特异性引物及探针 ,制备寡核苷酸芯片。用Cy3标记的引物 ,利用不对称PCR技术扩增DNA片段 ,将扩增的DNA片段与芯片上的探针杂交 ,用荧光扫描仪检测并分析信号。结果 建立的基因芯片能够检测恙虫病东方体标准株DNA的特异性荧光信号。具有特异、灵敏、快速的优点。结论 成功制备的基因芯片有望应用于恙虫病东方体多种样本的检测 ,为恙虫病提供最为理想的诊断方法。