甘蔗割手密种NAC转录因子ATAF亚家族鉴定及栽培品种ScNAC2基因的功能分析

NAC (NAM, ATAF和CUC)是陆生植物特有的转录因子家族,包含18个亚家族,其中ATAF亚家族成员广泛参与生物和非生物胁迫应答过程。本研究基于甘蔗割手密种基因组数据和栽培品种ROC22的cDNA文库,首先,通过比较基因组学方法,对ATAF亚家族成员进行鉴定、蛋白多序列比对、系统进化分析及启动子区域顺式作用元件预测;其次,从甘蔗栽培品种克隆获得割手密种ATAF亚家族成员SsNAC2的同源基因ScNAC2,在生物信息学分析基础上,采用qRT-PCR技术分析该基因的组织特异性表达模式,及其在不同外源胁迫下的表达特性;最后,对ScNAC2基因的编码蛋白进行亚细胞定位和转录激活活性试验。结果表明,一共鉴定到6个ATAF亚家族成员,开放读阅读框在889~1017bp之间,相对分子量介于32.067~35.819kD之间,理论等电点分布在5.09~8.92之间,所有成员的编码蛋白被预测均定位于细胞核上。这些基因的Ka/Ks比值均小于1,表明纯化选择在进化过程中起重要作用。蛋白的氨基酸序列比对显示,ATAF亚家族成员都含NAM保守结构域(由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ亚结构域组成)。系统进化分析揭示,禾本科的甘蔗、高粱、玉米与水稻亚家族成员都聚类在一起,表明有较近的亲缘关系,同时拟南芥、水稻、玉米和高粱等40个ATAF亚家族成员分为两个组(Group A和Group B),其中玉米ATAF亚家族发生明显的基因扩增现象。此外, ATAF亚家族成员启动子区域均包含响应低温、干旱和激素等逆境胁迫的顺式作用元件,推测其参与多种生物和非生物胁迫的应答过程。进一步,从甘蔗栽培品种ROC22中克隆获得ScNAC2基因的cDNA全长序列(GenBank登录号为OL982539),其开放读码框为891bp,编码296个氨基酸残基;该基因的编码蛋白与割手密种ATAF亚家族GroupB中SsNAC2蛋白的氨基酸序列相似性为97.99%。qRT-PCR表达分析结果表明, ScNAC2基因在甘蔗不同组织中组成型表达,在蔗叶和蔗皮中表达量高于蔗肉、蔗芽和蔗根;在水杨酸和茉莉酸甲酯胁迫下,表达量显著下调;在脱落酸、4℃低温和氯化钠胁迫下, ScNAC2基因的表达呈现由低到高的模式,且差异达显著水平。亚细胞定位结果显示, ScNAC2-GFP融合蛋白定位在细胞核上。转录激活活性试验表明, ScNAC2蛋白不具有转录自激活活性。以上结果为深入解析甘蔗NAC-ATAF亚家族成员在响应生物和非生物胁迫应答中的生物学功能奠定了基础,为甘蔗抗性分子育种提供潜在的基因资源。

蔓茎堇菜总黄酮提取工艺初探

分别采用热水浸提法、甲醇浸提法和乙醇浸提法来提取蔓茎堇菜样品的总黄酮 ,并以芦丁为标准品 ,用紫外分光光度法在 2 6 5nm处测定各提取液的总黄酮含量 .结果表明 ,甲醇浸提法和乙醇浸提法显著优于热水浸提法 ,而用 70 %乙醇为提取溶剂时效果最佳 .研究结果可为利用蔓茎堇菜工业化生产黄酮类药用成分提供科学依据 .

甘蔗硫氧还蛋白基因ScTRXh1的克隆及表达特性分析

硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)家族是一类古老的小分子蛋白,已被证明在维持生物体内氧化还原平衡、调控生物信号传导和应答多种非生物逆境胁迫中起重要作用。本研究从甘蔗(Saccharumcomplex)茎全长cDNA文库中分离克隆了一个甘蔗硫氧还蛋白h型基因的cDNA全长序列,命名为ScTRXh1。ScTRXh1全长786bp,5'非翻译区长96bp,3'非翻译区长306bp,开放读码框长384bp,共编码127个氨基酸。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中ScTRXh1基因的表达在处理前期分别受到ABA的抑制和H2O2的促进;PEG和NaCl胁迫处理对ScTRXh1基因表达的影响不显著;甘蔗中ScTRXh1基因的表达受SA的诱导而显著上调,其表达丰度在处理周期内维持在对照的6倍以上。以上结果表明ScTRXh1基因参与了甘蔗对SA、ABA和氧化胁迫等逆境因子的应答过程。甘蔗不同组织器官的定量表达结果分析表明,ScTRXh1基因在甘蔗根、茎和芽中的相对表达丰度高,分别是其在叶中的33倍、17倍和12倍以上。本研究结果为后续TRX基因在甘蔗抗逆相关机理研究和抗逆育种中的应用奠定了基础。

甘蔗叶片总蛋白提取及双向电泳条件的改进

针对甘蔗叶片中含有大量酚类和色素等干扰物质的现象,通过对甘蔗叶片蛋白样品制备、上样量和电泳条件等方面做了必要改进,建立了一套适用于甘蔗叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)方法。

利用改进的Oligo-Capping法构建甘蔗茎全长cDNA文库

Oligo-Capping法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一。笔者在引进、消化和吸收的基础上,通过对特异引物和接头序列的设计,及cDNA扩增反应条件的优化,对该方法进行了一些切实可行的改进,形成了一套简便易行的技术体系。利用本研究中改进的Oligo-Capping法,成功地构建了甘蔗茎全长cDNA文库。综合评价结果表明,本研究中所构建的甘蔗茎全长cDNA文库的库容大于2.5×106cfu,重组率为91%,全长率高达88.9%。本文库的构建为进一步甘蔗茎中全长基因的克隆和功能基因的表达分析奠定了基础。

银松素合酶基因地高辛标记RNA探针的合成

目的:体外转录合成银松素合酶(PS)基因地高辛标记反义RNA探针。方法:通过双酶切把PScDNA全长序列接到pBlueskriptⅡKS(+)的多克隆位点上;同时,经由NCBI比对确定PScDNA的特异序列,设计含有SalⅠ和XbaⅠ这2个酶切位点的上、下游引物,用PCR法扩增含有该位点的目的片段,并连接到pBlueskriptⅡKS(+)的多克隆位点上;最后利用pBlueskriptⅡKS(+)上的启动子T7,用T7RNA聚合酶在体外转录合成地高辛标记PS全长及特异序列的反义RNA探针。结果:通过对构建探针的单、双酶切,PCR及电泳鉴定,表明成功合成了PS基因地高辛标记的全长及特异序列的反义RNA探针。结论:RNA探针的合成为后续马尾松PS基因表达的RNA原位杂交研究打下了基础。

差异显示技术及其在植物研究中的应用

简要概述了差异显示技术的基本原理和过程及其在植物研究上的应用和进展.

甘蔗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因Sc-SAMDC的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗(Saccharum officinarum)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因,并进行序列特征、原核表达和不同逆境胁迫下表达特性分析。【方法】通过对甘蔗茎全长cDNA文库测序和分析,获得SAMDC基因cDNA全长,命名为Sc-SAMDC,并进行序列分析。随后将编码S-腺苷蛋氨酸脱羧酶的cDNA片段克隆到原核表达载体pET29a(+)中,构建融合表达质粒,转化至Esherichia coli BL21(DE3)中进行表达。最后利用定量PCR技术分析甘蔗幼苗中该基因在不同外源胁迫下的表达特性。【结果】序列分析显示,甘蔗Sc-SAMDC基因(GenBank Accession number:GQ246459)cDNA全长1968bp,存在3个读码框(袖珍读码框tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),mORF长1200bp,编码399个氨基酸的SAMDC酶原,预测分子量为43.6kD,该酶原含有两个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域)。原核表达产物经SDS-PAGE表明,Sc-SAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为50kD。定量PCR分析表明,Sc-SAMDC基因在聚乙二醇(PEG)、NaCl、水杨酸(SA)和H2O2外源胁迫下表达特性不同,受PEG和NaCl的诱导,受SA和H2O2的抑制。【结论】本研究成功地克隆了Sc-SAMDC基因并在原核生物中进行了表达研究,分析了该基因的表达特性,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。

福州地区甘蔗黄叶病病原分子鉴定及电镜检测

电镜观察表明,感病甘蔗叶片的韧皮部伴胞内存在着大量类似甘蔗黄叶病毒(SCYLV)的病毒粒子;利用RT-PCR扩增出556bp的目的片段,氨基酸和核苷酸序列分析表明,该片段是SCYLV外壳蛋白基因的一部分,与其他国家SCYLV分离物同源性达95%以上;应用组织印迹杂交免疫检测技术,在YLS病症的叶片中脉韧皮部出现紫红色斑块,呈阳性反应。综合分析认为福州地区甘蔗黄叶病的病原体为SCYLV。

甘蔗黄叶病毒的RT-PCR检测技术

以甘蔗黄叶病毒(ScYLV)特异性引物YLSF111和YLSR462为引物,对福建蔗区8个罹病品种的疑似病株进行RT-PCR检测,扩增出352 bp特异性片段.将PCR产物克隆后测序,序列分析表明,该片段是ScYLV外壳蛋白(CP)基因的一部分,核苷酸和氨基酸序列同源性达95%以上,与美国、印度、巴西等国家ScYLV分离物(GeneBank登录号分别为AF157029、AY236971、AF141385)CP基因同源性达100%,证实我国福建地区甘蔗黄叶综合症的病原体为ScYLV.本研究同时建立了ScYLV的RT-PCR检测技术.

灰木相思蛋白质组双向电泳条件的优化

针对灰木相思(Acacia implexa Benth.)蛋白质提取过程中含有大量色素和酚等干扰物质的现象,进行了实验条件的优化,结果显示:选择含较少次生物质量的组培苗为实验材料更易得到清晰的双向电泳图谱,在裂解液中添加硫脲更有利于提高蛋白溶解度,第一向等电聚焦固相pH梯度胶条(24 cm)的最适蛋白上样量为1000μg,表明采用优化后的双向电泳体系提高了灰木相思总蛋白双向电泳的分辨率和重复性,建立起一套适用于灰木相思总蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)方法.

甘蔗条纹花叶病毒 P3 蛋白与甘蔗 Rubisco 大亚基互作的研究

该研究以甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)的P3蛋白(SCSMV-P3)为诱饵,采用酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system,Y2HS)从甘蔗酵母文库中筛选到1个编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)大亚基的基因,命名为ScRbcL。序列分析表明,该基因开放读码框(open reading frame,ORF)长度为1 337bp,编码478个氨基酸残基。Y2HS和双分子荧光互补(bimolecular flourescence complementation,BiFC)实验表明,ScRbcL与SCSMV-P3存在互作关系。研究认为SCSMV-P3与ScRbcL的互作可能是SCSMV侵染甘蔗导致花叶症状发生的分子基础。

基因枪法获得转cry1Ac基因甘蔗的研究

根据定向克隆原则,以pGreenⅡ0229为载体骨架,cry1Ac为目的基因,bar为筛选标记基因,构建了大小为8602bp的植物表达载体pUBCG0229-cry1Ac。酶切结果表明,构建的载体pUBCG0229-cry1Ac结构完全正确。用基因枪轰击法将pUBCG0229-cry1Ac质粒DNA转化甘蔗(Saccharum Complex)品种福农95-1702和桂糖94-119的胚性愈伤组织,使用PPT(phosphinothricin)对轰击后的材料进行继代、分化和生根筛选,移栽成活后使用Basta溶液喷洒进行初步筛选,共获得86株抗性植株,通过PCR检测、Dot-Southern检测及PCR产物测序,证明已将cry1Ac基因整合到其中22株甘蔗基因组中。

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。

甘蔗栽培种单倍体基因组SSR位点的发掘与应用

甘蔗是世界上最重要的糖料作物之一,由于尚未完全破译栽培种基因组,导致SSR标记匮乏,难以覆盖全基因组,限制了甘蔗遗传研究的进展。本研究以栽培种R570的4660个BAC文库片段序列(累计总长为382 Mb,预测到25,316个编码蛋白基因)组装成的一套甘蔗单倍体基因组的模板,利用MISA (Microsatellite identification tool)软件,发掘SSR位点;并综合分析其与4种禾本科植物(高粱、玉米、水稻和二岁短柄草)SSR位点的分布特征;选取50对以TG和AG重复基序的SSR引物,分别利用4个甘蔗属材料(R570、ROC1、LA purple和SES208)和24个重要甘蔗亲本,对SSR引物进行扩增效率验证和多态性分析。共发掘到27,241个SSR位点,平均每个BAC片段有6.29个SSR位点,平均密度为71.33个SSR Mb?1,远低于高粱的平均密度(350.00个SSR Mb?1)。在重复基序中,占比前2位的分别为单核苷酸基序(11,079个)和三核苷酸重复基序(6447个),合计占总SSR位点数的64.33%。与甘蔗不同的是, 4种禾本科植物中的三核苷酸基序类型数量最多、占比最大。此外,在单核苷酸重复基序中, A/T所占比例最高,为84.8%, C/G所占比例最低,为15.2%;在三核苷酸重复基序中, TGT/ACA所占比例最高,为16.04%。总之,禾本科植物基因组富含A/T的基序。在50对SSR引物(TG基序41对和AG基序9对)的多态性验证中,共有45对(90%)能够扩增出清晰的条带,其中35对(70%)在4个甘蔗材料上呈现多态性。进一步利用20对多态性较高的SSR引物对24个甘蔗重要亲本材料进行分析,共扩增到95个等位基因,平均每对引物扩增4.75个,验证了这些引物应用于甘蔗遗传多样性研究的可行性。本研究鉴定的甘蔗栽培种单倍体基因组SSR标记,有效增加了甘蔗遗传研究中可用的分子标记数量,可直接用于甘蔗群体遗传多样性分析和重要性状遗传机制的解析,为甘蔗分子育种的深入研究奠定了基础。

凝胶柱层析分离虎杖中白藜芦醇的研究

本论文初步探讨了虎杖中白藜芦醇分离纯化的工艺条件,比较了不同溶剂、不同浓度、不同流速洗脱条件下白藜芦醇样品在LH-20凝胶层析柱上的分离效果,以及虎杖的乙醇提取液通过氯仿、乙酸乙酯萃取,凝胶柱层析分离后的成分变化,实验表明,当以甲醇为洗脱液,浓度为60%,流速为0.5mL/min时,白藜芦醇样品的分离效果最好。采用中压液相色谱检测收集到的白藜芦醇纯度(以白藜芦醇峰面积占总峰面积计算)可达80.34%,回收率达86.16%。

甘蔗单花粉全基因组扩增(WGA)与SCoT分子标记研究

从一个完整的甘蔗花粉囊中分离出单个花粉粒．利用特制取样器进行收集，采用碱裂解法释放单花粉DNA．裂解液可以直接作为WGA模板进行全基因组扩增．制备出单个花粉粒大量DNA。通过5SrRNA—ITS鉴定WGA产物真实性．并以目标起始密码子多态性标记对真实的WGA产物进行分析，显示出丰富的多态性。利用NTSYSpc软件分析花粉粒间遗传距离，并进行聚类分析，显示单花粉间遗传距离变幅为0．0888-0．3654，在相似系数0．187处．受试花粉粒中的36个明显分为2组．占总数的69％。说明减数分裂染色体重组过程中，有一定比例的基因位点为多数花粉粒所共有。根据SCoT标记聚类图可将所有供试花粉分为4大类．不同类花粉粒的分布具有一定的规律性．

甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因原核表达研究

本研究主要目的是构建ScYLV-CP基因的原核表达载体,表达ScYLV-CP蛋白。采用PCR扩增出CP基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体中,再经双酶切、亚克隆到表达载体中,构建该基因的表达载体pET-29 a-CP,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳。酶切鉴定表明表达载体内插入片段正确,在大肠杆菌中诱导后,出现一条分子量约为22 kDa蛋白带,与CP基因开放阅读框架的理论推算值21.719 kDa相符。研究表明甘蔗黄叶病毒外壳蛋白能在原核细胞中高效表达,为建立甘蔗黄叶病毒血清学快速检测技术奠定基础。

宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法建立

利用宿根矮化病菌的特异检测引物,构建竞争定量PCR检测的非同源模板,建立宿根矮化病菌的竞争定量PCR检测方法。实验中非同源模板(竞争模板)构建是采用PCR方法对大肠杆菌基因组进行低严谨度扩增,回收合适的DNA片段并将其构建到T-esay载体上,通过测序和序列比对,除两端引物序列完全相似外,其余部分没有同源性,因此可以作为定量检测的非同源模板。通过计算非同源模板的拷贝数,进行竞争定量PCR检测宿根矮化病,建立宿根矮化病菌的标准竞争曲线和直线回归方程。本研究建立的竞争定量PCR检测方法操作简单、特异性和敏感性高,适合于宿根矮化病菌的检测,并可为其它病菌竞争定量PCR检测方法的建立提供参考。