猪轮状病毒G9P[7]型云南株的分离鉴定及VP4和VP7基因测序分析

为确定云南省某猪场仔猪腹泻的病原,对送检腹泻病仔猪小肠组织样品进行猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)RT-PCR检测,将PoRV检测阳性样品处理后接种至MA-104细胞进行PoRV分离;对分离毒株进行间接免疫荧光、电镜观察、胶体金检测和VP4、VP6、VP7基因测序及遗传进化分析。结果显示,仔猪肠道组织样品经终浓度20μg/mL的胰酶在37℃孵育2 h,能在MA-104细胞上增殖传代,第3代出现稳定的细胞病变,盲传20代,每隔5代进行PoRV的检测;间接免疫荧光试验可见特异性荧光,胶体金和RT-PCR检测均为PoRV阳性,电镜观察可见病毒粒子直径约为65 nm,呈车轮状,符合PoRV粒子典型形态特征,将该分离株命名为PoRV YN-A株。基因同源性比较和遗传进化树分析显示,YN-A株的VP6基因序列与国内A群GD株的同源性为99.93%,VP7与中国G9型NJ2012株的同源性为99.12%,VP4与美国P[7]型OSU株的同源性为98.91%,确定该分离株为猪A群轮状病毒G9P[7]型。YN-A株VP7序列在9个氨基酸位点存在点突变,即aa9(I→V)、aa16(V/T→I)、aa44(A→V)、aa100(D/E→N)、aa212(T/A→K)、aa221(N→S)、aa225(V→A)、aa271(I→V)、aa267(D→E)。首次从云南地区的腹泻仔猪小肠组织中成功分离到1株G9P[7]型的新基因型PoRV毒株,为PoRV的致病性、分子生物学特性研究及PoRV G9优势基因型新疫苗研发奠定了基础。

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GD2022株的分离鉴定及遗传进化分析

为了解广东省欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-1)流行情况,将RT-PCR检测PRRSV-1阳性的病料(肺脏和淋巴结)接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs)进行病原分离鉴定,以分离毒株核酸作为模板,对分离的PRRSV-1进行全基因克隆和测序,并与国内外PRRSV-1和PRRSV-2参考毒株序列进行同源性及遗传进化分析。结果显示,成功分离1株PRRSV-1,命名为GD2022株,其接种PAMs可引起典型的细胞病变,从出现病变的F5细胞中提取核酸,用PCR分段扩增出PRRSV-1 GD2022株10个基因组片段,分别连接到pCE2 TA/Blunt-Zero载体进行测序,拼接后获得PRRSV-1 GD2022株全基因组长15058个核苷酸(不包含polyA尾)。同源性分析显示,该分离株全基因组序列与PRRSV-1参考毒株(LV株)和PRRSV-2参考毒株(VR2333株)核苷酸序列同源性分别为87%和59.7%。遗传进化树分析显示,全基因序列和ORF5基因与国内外PRRSV-1毒株为同一进化分支,且与疫苗毒分支较远,推断分离株为1株PRRSV-1,属于基因亚型1。氨基酸序列比对分析显示,ORF3和ORF4重叠区域缺失3个核苷酸,导致GP3蛋白和GP4蛋白分别在第245和第65氨基酸位点缺失了1个氨基酸,且与LV株比对,GD2022毒株GP5的氨基酸序列在中和抗原表位第33氨基酸位点(D→A)出现点突变,在高变区第56氨基酸位点(D→A)和第63氨基酸位点(G→D)出现两处突变。重组分析显示,GD2022毒株未发生重组事件。成功分离鉴定1株PRRSV-1毒株,为国内PRRSV-1生物学特性研究提供了材料,也为了解广东省内PRRSV-1流行情况及变异特点提供参考依据。

猪丁型冠状病毒感染麻黄鸡的研究

为研究猪丁型冠状病毒(PDCoV)跨物种传播宿主谱及其致病性,将PDCoV(HN-17毒株)接种至6日龄SPF麻黄鸡并采集感染鸡的组织器官,通过临床症状、RT-PCR、病理组织切片分析等对其组织嗜性、组织病理学变化进行系统研究。结果表明,口服接种PDCoV的麻黄鸡出现腹泻等临床症状,在感染鸡的肺脏、空肠、直肠、肾脏中均检测到PDCoV的RNA,感染鸡的肺脏、空肠产生以出血、炎性细胞浸润为主要特征的组织病理学变化,证明PDCoV可以感染麻黄鸡并致病。证实猪丁型冠状病毒可感染麻黄鸡,为PDCoV的跨物种传播及该病防控提供参考。

3种猪冠状病毒N基因密码子偏好性及宿主适应机制研究

【目的】研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)的N基因密码子偏好性差异及其影响因素。【方法】从GenBank数据库中下载上述3种猪冠状病毒(PoCoV)的全基因组序列,通过EMBOSS explorer、CALcal、DAMBE及CodonW等网站及软件计算有效密码子数(ENC)、相对同义密码子使用度(RSCU)等参数并进行ENC绘图、奇偶偏好性和中性绘图分析等。【结果】3种猪冠状病毒的N基因序列的ENC分布在48.99~54.96,其中PEDV、TGEV和PDCoV的ENC分别为53.74±0.61、50.09±0.88和0.72±0.65;RSCU分析显示,3种猪冠状病毒N基因偏好的密码子各不相同,但一般都偏好以U结尾;ENC绘图分析显示,3种猪冠状病毒的N基因数值点均位于标准曲线下方位置;奇偶偏好性分析显示全部散点位于y=0.5以下,且矢量向左下侧偏倚;中性绘图分析显示,3种病毒N基因绘图分析中回归曲线的斜率均接近0。3种猪冠状病毒的S和N基因在牛、猪、犬、人、鸡中的CAI值逐渐增高,RCDI值逐渐降低并接近于1。【结论】PEDV、TGEV、PDCoV的N基因密码子偏好性存在差异且密码子偏好性均较弱,3种猪冠状病毒的N基因表现为“CpG二核苷酸缺失”;自然选择作用是这3种猪冠状病毒N基因密码子偏好性形成的主要进化压力;人、猪、鸡3种宿主均适合3种猪冠状病毒的N基因表达,且PDCoV的S和N基因均更适合在鸡中表达。