利用传统方法在畜禽特定基因座上进行基因组修饰时,只能通过在体细胞中进行同源重组再经细胞核移植实现。传统同源重组方法的困难性和低效性阻碍了基因修饰在畜禽遗传育种中的广泛应用。近年来,位点特异性核酸内切酶的发现为靶向基因修...利用传统方法在畜禽特定基因座上进行基因组修饰时,只能通过在体细胞中进行同源重组再经细胞核移植实现。传统同源重组方法的困难性和低效性阻碍了基因修饰在畜禽遗传育种中的广泛应用。近年来,位点特异性核酸内切酶的发现为靶向基因修饰提供了一条更直接的途径,主要由于这些酶能直接在DNA序列上进行一步式的基因编辑。成簇规律间隔短回文重复序列/Cas关联蛋白9(clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)是一种RNA导向的DNA内切酶,精准定位于特定的靶位点,高效完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas9技术作为精准而强大的第3代基因组编辑工具,已经成功应用于猪、牛、山羊、绵羊和鸡上,这些CRISPR/Cas9基因编辑畜禽可作为研究人或畜禽生理和病理的生物模型、生产功能性蛋白质的生物反应器或器官移植的供体。特别是在畜禽生产方面,CRISPR/Cas9基因编辑可用于改善生产遗传特性及畜产品质量,提高畜禽对疾病的抵抗力。作者对当前畜禽中特定位点基因组修饰的CRISPR/Cas9技术的原理及基因组编辑在畜禽育种中应用的最新进展进行了综述,以期为推进CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究提供参考。展开更多
文摘【目的】探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells,BSMSCs)增殖和成肌分化的影响。【方法】利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测METTL3在BSMSCs分化前后mRNA和蛋白表达水平的差异。设计合成METTL3干扰RNA(si-METTL3),且构建METTL3的过表达载体pcDNA3.1-METTL3,分别转染至BSMSCs中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测转染效果和BSMSCs增殖标志因子盒转录家族成员7(paired box 7,Pax7)的表达情况,EdU检测细胞增殖情况。将转染si-METTL3和pcDNA3.1-METTL3的BSMSCs进行体外诱导分化,通过光学显微镜观察BSMSCs进入分化期的细胞形态,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测BSMSCs分化标志因子肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)、肌细胞生成素(myogenin,MyoG)的表达情况。通过比色法检测干扰或过表达METTL3后,BSMSCs不同时期的m 6 A RNA甲基化水平。【结果】BSMSCs分化后METTL3蛋白表达水平极显著高于增殖期(P<0.01);干扰或过表达METTL3后,Pax7的mRNA水平以及蛋白水平均无显著变化(P>0.05),EdU阳性细胞率与对照组相比均无显著差异(P>0.05);干扰METTL3后,细胞肌管数量明显增多,肌管直径明显增大,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m 6 A RNA甲基化水平均极显著下调(P<0.01);过表达METTL3后,细胞肌管数量明显减少,肌管直径明显变小,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著降低(P<0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m 6 A RNA甲基化水平均极显著上升(P<0.01)。【结论】METTL3对BSMSCs的增殖过程没有显著影响,但对BSMSCs的成肌分化过程具有调控作用,并影响BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平。干扰METTL3可以促进BSMSCs的成肌分化进程,降低BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平;而过表达METTL3会抑制BSMSCs的分化,提高BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平。试验结果为进一步探明METTL3在牛肌肉发育中的调控机制奠定了基础。
文摘利用传统方法在畜禽特定基因座上进行基因组修饰时,只能通过在体细胞中进行同源重组再经细胞核移植实现。传统同源重组方法的困难性和低效性阻碍了基因修饰在畜禽遗传育种中的广泛应用。近年来,位点特异性核酸内切酶的发现为靶向基因修饰提供了一条更直接的途径,主要由于这些酶能直接在DNA序列上进行一步式的基因编辑。成簇规律间隔短回文重复序列/Cas关联蛋白9(clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)是一种RNA导向的DNA内切酶,精准定位于特定的靶位点,高效完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas9技术作为精准而强大的第3代基因组编辑工具,已经成功应用于猪、牛、山羊、绵羊和鸡上,这些CRISPR/Cas9基因编辑畜禽可作为研究人或畜禽生理和病理的生物模型、生产功能性蛋白质的生物反应器或器官移植的供体。特别是在畜禽生产方面,CRISPR/Cas9基因编辑可用于改善生产遗传特性及畜产品质量,提高畜禽对疾病的抵抗力。作者对当前畜禽中特定位点基因组修饰的CRISPR/Cas9技术的原理及基因组编辑在畜禽育种中应用的最新进展进行了综述,以期为推进CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究提供参考。