致羔羊脑炎粪肠球菌asa1、ace和esp基因的克隆与原核表达

肠球菌是人和动物肠道内仅次于大肠杆菌的常在菌，通常不引起发病，当抗生素大量使用或宿主免疫力低下时，宿主与肠球菌之间的共生状态失衡，肠球菌离开正常寄居部位进入其他器官，在毒力因子的作用下，引起感染性疾病的发生发展[1-2]。肠球菌引起的感染已越来越普遍，威胁着人类健康，也影响着畜牧业的发展[3-5]。目前发现的肠球菌毒力因子基因有10余种，在众多毒力因子基因中，有的基因控制产生特定的毒素，有的基因控制产生特定的蛋白质，这些物质吸附在宿主细胞或细胞外基质，抵抗巨噬细胞吞噬，造成组织损伤以及免疫逃避等，有的甚至能直接损伤宿主细胞[6]。因此研究肠球菌的毒力因子，有助于进一步明确肠球菌的致病机制，为寻求新的治疗方法和预防感染提供理论依据。

致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05 LuxS基因的克隆与原核表达

采用PCR技术从致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05基因组中扩增得到LuxS基因的全序列,对其进行分析,同时与其他细菌相应基因序列及编码的氨基酸进行同源性分析;构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行鉴定。结果显示,该粪肠球菌XJ05的LuxS基因全长459bp,编码152个氨基酸,具有功能序列HXXEH,核苷酸同源性与GenBank上的枯草芽胞杆菌和粪肠球菌V583同源性最高,分别为61.2%和100%;构建的重组质粒经诱导后表达分子质量为20ku的蛋白质,Western blot检测显示特异性条带。说明XJ05的luxS基因与肠球菌V583和枯草芽胞杆菌亲缘关系较近,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。

2株枯草芽孢杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌试验研究

本试验旨在检测2株枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌和沙门氏菌抑菌作用。以致病性大肠杆菌和沙门氏菌作为指示菌,采用2株枯草芽孢杆菌与大肠杆菌和沙门氏菌同时接种及先后接种的方法,对其与大肠杆菌和沙门氏菌的生物颉颃作用进行了研究。结果表明,先接种枯草芽孢杆菌再接种致病菌抑制作用最明显且在24h时抑菌作用最强,同时接种枯草芽孢杆菌和致病菌抑制作用次之,先接种致病菌再接种枯草芽孢杆菌的抑制作用最弱。提示,2株枯草芽孢杆菌对致病性大肠杆菌和沙门氏菌都有一定的抑制作用,但抑制作用的强弱有差异,且与枯草芽孢杆菌和致病菌接种的时间长短有关。

抗犬瘟热高免卵黄抗体的制备及效价的检测

为了制备出抗犬瘟热高免卵黄抗体并进行抗体效价检测,以便为抗犬瘟热高免卵黄抗体用于患病犬的临床治疗奠定基础。本研究用自行设计的免疫程序对健康产蛋鸡用犬瘟热和犬细小病毒二联疫苗进行免疫,同时使用卡介苗和白介素-16(IL-16)作为佐剂,用石河子地区患犬瘟热的病犬做组织灭活苗对产蛋鸡进行了强化免疫注射,用IHA(间接血凝)方法进行了卵黄抗体检测,对检测出效价最高的批次用盐析法粗提制备了抗犬瘟热卵黄抗体。结果显示:从疫苗开始注射后第20-102天收集的鸡蛋,其卵黄抗体效价均在1:64以上,可以用于临床治疗,其中第77-84天卵黄抗体效价最高(1:8192)。结论:本研究设计的免疫程序合理,用IHA方法检测出的高效价卵黄抗体可以用盐析法制备出抗犬瘟热高免卵黄抗体。

优良枯草芽胞杆菌的筛选及对小鼠安全性评价

为进一步鉴定、分析和评价分离于鸡粪便的13株芽胞杆菌,根据枯草芽胞杆菌16SrRNA序列设计特异性引物,PCR扩增13株分离于鸡粪便的芽胞杆菌,将扩增片段测序并分析同源性;将鉴定的枯草芽胞杆菌进行耐酸、耐胆盐、耐高温等试验,同时用不同剂量菌液分别以不同方式感染小鼠,定期称重、观察各脏器病理变化和计算主要脏器系数。结果显示,Q04、Q05、Q09与GenBank公布的枯草芽胞杆菌16S rRNA序列同源性为99%,且Q04在pH2.5,胆盐浓度2g/L以及100℃时生长良好;感染小鼠全部健康存活,体重均有增加;小鼠脏器无病变,脏器系数无显著差异(P>0.05)。由结果可知,分离鉴定菌株Q04、Q05、Q09为枯草芽胞杆菌,其中Q04具有更好的生物学特性,并且对小鼠安全无毒,可作为微生态制剂的候选菌株。

抗犬瘟热高免卵黄抗体IHA检测方法的建立

目前检测卵黄抗体的方法很多,但IHA方法具有简便快速的优点,本研究的目的是为了建立抗犬瘟热高免卵黄抗体检测方法。采用犬瘟热病毒和犬细小病毒二联疫苗处理作为疫苗抗原,用犬瘟热病死犬的肝脏部分处理后作为组织抗原,制备敏化绵羊红细胞,用IHA方法确定了犬二联疫苗抗原和犬瘟热病毒组织抗原的最适含量。二联疫苗提取抗原的含量为0.7 mg/mL致敏红细胞时,与犬瘟热单克隆抗体反应显著,抗体效价为1∶256;而患犬瘟热松狮犬的肝脏组织抗原蛋白浓度为0.5mg/mL,与犬瘟热单克隆抗体反应显著,抗体效价为1∶128。经过IHA验证,制备的松狮犬瘟热肝组织抗原,蛋白含量0.5 mg/mL 1%致敏红细胞,对应的单抗、鸡血清均出现了凝集,阳性对照也出现凝集,阴性对照未出现凝集。建立的IHA抗体检测方法,为准确检测制备抗犬瘟热高免卵黄抗体的效价奠定了基础。

土源枯草芽胞杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

从土壤中采集样品分离枯草芽胞杆菌,检测分离株的生物学特性进而筛选出性状优良的益生菌。采集土样采用倾注培养法,通过培养特征、形态观察及生化鉴定,结合特征性16SrRNA PCR扩增及序列分析鉴定菌株;采用平板稀释法对分离株进行了耐酸性试验、耐胆盐试验、耐高温试验及耐药试验。从23份土壤中分离鉴定出10株枯草芽胞杆菌,其中2个菌株具有耐高温、耐胆碱、耐酸及耐药作用等良好的益生菌特性。

致羔羊脑炎粪肠球菌EF3183基因的克隆与生物信息学分析

为研究致羔羊脑炎粪肠球菌分离株表面蛋白EF3183基因的结构及功能,采用PCR方法扩增EF3183基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测其分子结构,推测其生物学功能,并构建系统进化树。结果显示:成功获得了长1060 bp的表面蛋白EF3183基因;经生物信息学分析,此序列包含有1个1056 bp的完整开放阅读框,编码351个氨基酸;无信号肽;有2个跨膜区;抗原表位预测显示表面蛋白EF3183有15个抗原表位;系统进化树分析显示致羔羊脑炎粪肠球菌XJ11株表面蛋白EF3183基因与粪肠球菌v583的EF3183基因的进化距离最近。本研究成功获得了致羔羊脑炎粪肠球菌EF3183基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。

不同动物来源大肠埃希菌iss基因检测及致病性研究

研究不同动物来源大肠埃希菌iss基因分布及其致病性。分别将分离于发病猪、鸡和犊牛的44株大肠埃希菌计数后腹腔注射小白鼠，观察临床症状，记录发病及死亡情况；采用PCR方法分别扩增不同动物来源的44株大肠埃希菌的iss基因存在情况，同时对部分PCR扩增产物测序并进行同源性分析。感染后小白鼠出现不同程度的临床症状。其中有14株对小白鼠的致病性最强，感染小鼠的死亡率达100％；有25株致病性较弱，死亡率为20％～80％；而另有5株接种感染后小鼠均无死亡；iss基因在致病性大肠埃希菌中的PCR扩增总频率为79．5％；在毒力较强大肠埃希菌中的PCR扩增频率为92．8％；在无致病力（或低毒力）大肠埃希菌中的PCR扩增频率为16．7％；部分基因片段核苷酸序列与参考序列之间同源性在91．6％～99．0oA。iss基因致病性强的菌株扩增频率明显高于其他菌株，且不同来源菌株iss基因片段变异程度不大。

不同动物来源肠球菌的分离鉴定及毒力因子基因的检测

为了探究不同动物来源正常菌群肠球菌携带10种毒力因子基因(asa1、ace、esp、cylA、gelE、EF0591、EF3314、asa373、efaA、sprE)的情况、分离株相同毒力因子基因相应序列之间的同源性、与致羔羊脑炎肠球菌和GenBank上登录的人源肠球菌同一基因相应序列的同源性,采用常规细菌分离法结合PCR方法对270份不同地区、不同动物来源的肛试样品进行肠球菌的分离鉴定,同时采用PCR方法检测肠球菌的10种毒力因子基因,对部分毒力因子基因扩增片段测序并进行同源性和系统进化分析。结果显示,从270份样品中共分离到259株肠球菌,其中13株携带3种毒力因子基因,31株携带4种毒力因子基因,39株携带5种以上的毒力因子基因,不同来源肠球菌所拥有的相同毒力因子基因片段之间的同源性均在90%以上。结果表明,不同动物来源正常菌群肠球菌的不同分离株分别携带10种毒力因子基因中的部分基因,某些菌株拥有较高的毒力因子基因组合,且这种组合因畜种和养殖环境的不同而存在差异。