法舒地尔阻断ROCK1触发C2C12成肌细胞呼吸功能异常介导的肌肉萎缩

目的明确法舒地尔(fasudil)能否阻断Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)激活导致的C2C12成肌细胞呼吸功能异常介导的肌肉萎缩。方法体外培养C2C12成肌细胞,给予2%的马血清诱导分化为成熟肌小管细胞。然后根据给予不同处理将其分成4组:Ad-GFP组,仅感染GFP腺病毒载体;Ad-ROCK1组,感染ROCK1腺病毒载体诱导细胞过表达ROCK1;Ad-GFPF组,感染GFP腺病毒载体,并给予10μmol/L法舒地尔刺激;Ad-ROCK1F组,感染ROCK1腺病毒载体诱导细胞过表达ROCK1,并给予10μmol/L法舒地尔刺激。通过Seahorse能量代谢分析仪评估不同刺激条件下C2C12成肌细胞的细胞耗氧率(OCR)及胞外酸化率(ECAR),以明确ROCK1过表达和法舒地尔刺激对C2C12成肌细胞呼吸功能的影响。采用MitoTracker○R红色荧光探针测定线粒体裂变情况。用蛋白质印迹法检测ROCK1、线粒体动力相关蛋白1(Drp1)及其磷酸化蛋白p-Drp1、肌肉萎缩相关蛋白E3泛素连接酶肌肉环指蛋白1(MuRF1)和肌肉萎缩F-box(MAFbx,又称Atrogin1)的表达。结果 Seahorse分析结果显示,与Ad-GFP组比较,AdROCK1组C2C12成肌细胞OCR及ECAR明显增加,细胞的基础呼吸、最大呼吸及偶联ATP产生所需的呼吸增加,差异均有统计学意义(P<0.01);MitoTracker○R荧光探针结果显示Ad-ROCK1组细胞线粒体裂变增加,线粒体大小频数分布左移。Ad-ROCK1F组C2C12成肌细胞OCR和ECAR较Ad-ROCK1组明显减少(P<0.05),基础呼吸和最大呼吸也降低(P<0.05)。Ad-ROCK1F组p-Drp1/Drp1比例、ROCK1、MuRF1和Atrogin1的表达均较Ad-ROCK1组减少(P<0.05)。结论法舒地尔作为ROCK1的抑制剂,可阻断体外培养C2C12成肌细胞ROCK1过表达导致的细胞呼吸异常,并减少线粒体动力相关蛋白的活性和肌肉萎缩相关蛋白的表达。

结肠参与慢性肾功能衰竭大鼠氧化应激的激活

目的探讨慢性肾功能衰竭(CRF)胃肠道症状的发生机制,明确结肠是否参与CRF氧化应激的激活。方法将30只雄性SD大鼠随机分为对照组(10只)和CRF组(20只),CRF组大鼠予以5/6肾切除建立CRF模型,对照组仅打开肾包膜后缝合。成模后10周处死大鼠,收集2组大鼠的血清及回盲瓣附近结肠组织。检测大鼠肾功能指标血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)以评估造模是否成功,检测大鼠血清及结肠组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(TAC)和8-羟脱氧鸟苷(8-OHdG)以评估氧化应激水平,检测泛素细胞色素C诱导核心蛋白酶Ⅰ(UQCRC1)mRNA和蛋白水平以评估线粒体功能。结果与对照组相比,CRF组血清BUN及SCr水平升高,提示造模成功;CRF组血清及结肠组织中MDA水平升高(P<0.05),但2组间8-OHdG和抗氧化指标SOD、TAC差异无统计学意义(P>0.05);CRF组结肠组织中UQCRC1蛋白水平较对照组低(P<0.05),但UQCRC1 mRNA水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CRF大鼠的结肠组织中存在氧化与抗氧化反应失衡现象,其机制可能涉及线粒体的功能障碍。