产生乳腺定位表达人CD14的转基因小鼠研究

将来自ＰＣＲ法合成的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５′端８９８ｂｐ上游区和人单核细胞表面分化抗原基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ片段构建的ＢＬＧ－ｈＣＤ１４融合基因纯化后，注入小鼠受精卵原核．实验共注射受精卵１１４９枚，经体外培养发育到２－细胞期的胚胎计９６８枚，发育率为８４．２％．从发育的胚胎中选择６３４枚移植到４６只假孕受体．其中１４只妊娠产仔，妊娠率３０．４％．妊娠受体共移植胚胎２０７枚，产仔４３只，产仔率２０．８％．经ＰＣＲ法检测８只为ＢＬＧ阳性整合，整合率２５．８％．检测泌乳的转基因阳性雌性小鼠，其中一只经过用生物素标记的鼠抗人ｈＣＤ１４单克隆抗体与琼脂糖凝胶转移片段简易杂交检测。

用PCR法构建乳腺特异性表达非乳蛋白基因的研究

将ＰＣＲ法分别从绵羊和人血基因组ＤＮＡ中扩增出的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５′端调控区８９８ｂｐ的片段和人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ的片段连接．连接片段插入ｐＵＣ１９ＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ位点，构建成ｐＢＬＧ－ｈＣＤ１４质粒．该质粒经ＫｐｎＩ及ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄＩＩ酶切、ＰＣＲ法扩增ＢＬＧ和ｈＣＤ１４分析后，进一步用３２Ｐ－ＢＬＧ探针杂交确证．用ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄＩＩ酶切质粒片段ＢＬＧ－ｈＣＤ１４产生转基因小鼠以检测ＢＬＧ－ｈＣＤ１４在乳腺的表达能力．用免疫杂交法证实在转基因阳性小鼠乳汁中表达了ｈＣＤ１４．

外源基因在转基因动物乳腺中的特异性表达研究

动物基因工程研究最大的突破就是转基因动物研究的进展．自八十年代初第一批转基因小鼠问世以来，转基因动物的研究已从方法学研究步入了应用性研究阶段．转基因动物除作为研究工具广泛地应用于发育生物学、免疫学、遗传学以及医学等生命科学领域外，外源基因在转基因动物的特异性表达，尤其是在乳腺的表达，又可将转基因动物用作生物反应器进行生物活性蛋白的生产而应用于商业生产．在转基因动物乳腺的特异性表达研究中，寻找乳蛋白基因调控构件是非常必要的，特别是获得高效而稳定表达的基因调控构件更为重要．迄今为止，已获得了多种乳蛋白基因调控构件．在这些构件的指导下从转基因动物乳汁中生产了不同的人体非乳蛋白，且都具有生物活性．

已知成分培养液中兔原核卵培养到胚泡的研究

用商业化ＲＰＭＩ１６４０添加１５ｍｇｍｌ－ＢＳＡ将１５４枚兔原核卵，经体外２４ｈ、４６ｈ、７０ｈ、９４ｈ和１１８ｈ培养，分别有９８．７％（１５２／１５４）、９８．１％（１５１／１５４）、９２．９％（１４３／１５４）、８６．４％（１３３／１５４）和７５．３％（１１６／１５４）的胚胎得到进一步发育．５６．５％（８７／１５４）经１１８ｈ培养后发育成胚泡．１４０ｈ后孵化率达３５．７％（５５／１５４）．将７０枚发育的４－细胞移植到５只受体，３只妊娠（６０％）产仔５只．结果表明在ＲＰＭＩ１６４０中添加ＢＳＡ，可完成兔受精卵植入前的发育，且发育的４－细胞在植入受体输卵管后，可发育到妊娠期满并产仔．

脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。

体细胞克隆山羊微卫星DNA分析

用 10对山羊微卫星DNA多态性引物对 2只体细胞克隆济宁青山羊、青山羊供体细胞、受体奶山羊母羊以及具有亲缘关系的 3只对照济宁青山羊进行微卫星DNA分析 .结果表明有 5对山羊微卫星DNA多态性引物 ,即SR CRSP1,SR CRSP5 ,SR CRSP6 ,SR CRSP7和SR CRSP2 4 ,扩增产物有明显的多态性 .扩增产物经过 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染 ,结果 2只体细胞克隆山羊的微卫星DNA指纹与供体细胞完全相同 ,而且不同于其受体母亲也不同于其他所有同品种不同个体的对照青山羊 .证明体细胞克隆山羊基因组来源于供体细胞 .

几种不同化学激活方法对牛卵母细胞孤雌激活的影响

为确定牛体细胞核移植胚胎的激活条件 ,比较了几种不同化学激活方法对牛卵母细胞激活的影响。选择明显具有第一极体的成熟卵母细胞 ,随机分为 9组 :1Ionomycin(I) +6 -甲氨基嘌呤 (D) (ID) ;2 I+D+细胞松弛素 B(CCB) (IDC) ;3I+放线菌酮 (X) (IX) ;4 I+X+CCB(IXC) ;5体积分数 7%乙醇 (E) +D(ED) ;6E+D+CCB(EDC) ;7E+X(EX) ;8E+X+CCB(EXC) ;9Sr2 + +CCB(SC)。Ionom ycin和乙醇的处理时间为 5min,6 - DMAP± CCB的处理时间为 4 h,放线菌酮± CCB的处理时间为 5 h,Sr2 + +CCB的处理时间为 10 h。培养36 h后 ,各组卵母细胞的卵裂率分别为 72 .0 % ,75 .5 % ,81.3% ,85 .1% ,81.7% ,82 .4 % ,74 .4 % ,78.1%和 5 1.0 % ;培养到 196 h时 ,各组的囊胚发育率分别为 18.2 % ,2 4 .5 % ,7.2 % ,11.9% ,11.1% ,19.4 % ,6 .7% ,12 .2 %和 2 .0 %。结果表明 ,在 10 mm ol/ L Sr2 +内培养 10 h不能有效地激活牛卵母细胞 ,Ionom ycin+6 - DMAP± CCB以及乙醇 +6 -DMAP+CCB结合使用可以有效地激活牛卵母细胞。Ionom ycin比乙醇对牛卵母细胞的激活作用强 ;6 - DMAP比CHX的激活效果好 ,激活液中

牛孤雌生殖胚与体外受精胚体外发育比较

从卵巢采集的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)经体外成熟培养24h后,随机分为2组分别用于孤雌激活与体外受精。在相同培养条件下,比较孤雌生殖胚与体外受精胚的发育率和发育速度。结果表明:将牛孤雌生殖胚与体外受精胚分别置于mSOFaa和mBECMaa培养液中培养,卵裂率(89.3%vs.80.1%;83.2%vs.82.5%)、囊胚发育率(27.5%vs.24.0%;28.9%vs.21.9%)和孵化率(58.7%vs.56.7%;51.5%vs.53.3%),均无显著差异(P>0.05);孤雌生殖胚与体外受精胚在体外发育的速度基本相同。对孤雌生殖胚胎进行培养可以代替体外受精胚胎筛选最佳体外培养系统。

牛供体细胞的来源、血清饥饿和预激活对核移植卵体外胚胎发育的影响

牛皮肤成纤维细胞经血清饥饿或预激活处理后获得核胞体 ,并注入去核卵母细胞内构建重组胚。检查重组胚 2 4h和 36h卵裂率以及 8d囊胚率 ,以评估供体细胞及其处理方法对体细胞核移植效果的影响。实验结果表明 :来自 3个年龄 (6、 18和 36月龄 )、 2个品系 (红安格斯肉牛和荷斯坦奶牛 )的 4头供体牛皮肤细胞重组胚的卵裂率和囊胚率均无差异。生长到完全汇合的 36月龄荷斯坦牛供体细胞血清饥饿 10～ 13d组重组胚的 36h卵裂率显著低于 0d (对照 )、 3～ 5d和 6～ 9d组 ,囊胚率显著低于 3～ 5d组 ;经 5 μmol/L离子霉素或7%乙醇预激活 5min重组胚的卵裂率和囊胚率均与对照组无差异。

免疫学方法鉴定小鼠早期胚胎性别的研究

用免疫学方法制备的Ｈ─Ｙ抗血清，通过细胞毒性试验检测昆明白系小鼠早期胚胎细胞表面的雄性特异性Ｈ─Ｙ抗原，从而鉴定早期胚胎的性别。将８─１６细胞期胚胎培养在Ｗｈｉｔｔｅｎ＇ｓ培养液中，并加入Ｈ─Ｙ抗血清和正常豚鼠血清，培养２４ｈ后，镜检胚胎可分为有反应和无反应两类。胚胎中一个或多个卵裂球溶解为有反应（Ｈ─Ｙ阳性）为雄性胚胎；胚胎完好无损为无反应（Ｈ─Ｙ阴性）为雌性胚胎。实验结果表明，１５２８枚胚胎经处理后４７．９％的胚胎为Ｈ─Ｙ阳性，５２．１％为Ｈ─Ｙ阴性，与昆明白系小鼠自然性别比率（♂５１．２％，♀４８．８％）比较两者无显著差异。Ｈ─Ｙ阴性胚胎经染色体核型分析，雌性胚胎鉴别准确率为８０％。

不同核移植方法对牛体细胞核移植效率的影响

以牛皮肤成纤维细胞为供体细胞 ,比较了电融合法和细胞质内注射法 2种核移植方法对体细胞核移植效率的影响。电融合法构建重组胚的效率显著低于细胞质内注射法 (4 7.1%比 89.0 % ,P<0 .0 1) ;重组胚培养 36 h后的裂卵率和培养 8d时囊胚发育率无明显差异 (76 .4 %比 73.2 % ,11.2 %比 12 .3% ;P>0 .0 5 ) ,但相对于操作的卵母细胞总数而言 ,电融合法得到的总囊胚发育率显著低于细胞质内注射法 (5 .6 %比 10 .9% ,P<0 .0 1)。结果表明 ,用细胞质内注射法进行体细胞核移植效率更高。将发育到桑椹胚和囊胚期的 95枚核移植胚胎移植到 33头受体牛 ,其中 31头受体牛在移植后第 2个情期前返情 ;1头受体牛在移植后 75 d返情 ,但未进行直肠检查 ,无法确定妊娠情况 ;1头受体牛在移植后 6 0 d未见返情 ,直肠检查确证妊娠 ,93d受体牛流产。胚胎移植结果表明 。

不同培养液对牛孤雌生殖胚胎和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

采用体外成熟的牛卵母细胞 ,经 5 μmol/LIonomycin 5min和 2mmol/L 6 DMAP + 5 μg/mLCCB 4h激活 ,分别在TALP +M 199(TM ,1∶2 )、BMOC +M 199(BM ,1∶2 )和CR1aa培养液内培养 ,2 4h和 3 6h各组卵母细胞的卵裂率分别为5 6.4%、5 5 .6%、5 3 .6%和 72 .0 %、75 .9%、79.0 % ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 8d后囊胚发育率分别为 18.2 %、2 1.4%和 2 9.3 % ,CR1aa内培养孤雌生殖胚的囊胚发育率显著高于TM (P <0 .0 1)。皮肤成纤维细胞构建的重组胚经同法激活后 ,分别在TM、BM和CR1aa内培养 ,2 4h和 3 6hBM和CR1aa内重组胚的卵裂率显著高于TM (4 9.7%、49.8%比 2 0 .5 % ;74.1%、73 .2 %比 5 0 .0 % ) (P <0 .0 1) ;虽然培养 8d后各组胚胎的囊胚发育率无显著差异 ,但CR1aa内重组胚的囊胚发育率稍高 (12 .3 %比 9.8%、11.5 % )。结果表明 ,CR1aa更适合孤雌生殖和体细胞核移植胚胎的体外培养。

供体细胞和去核卵母细胞的不同预激活对体细胞核移植胚胎体外发育的影响

研究用细胞质内注射法构建重组胚,比较了离子霉素和乙醇预激活供体细胞和去核卵母细胞对重组胚卵裂和体外发育的影响。结果表明:与未经处理的对照组相比,离子霉素预激活供体细胞时重组胚的卵裂率和囊胚发育率有所提高;而供体细胞和去核卵母细胞同时用离子霉素预激活,重组胚的卵裂率无明显提高,囊胚发育率下降;用离子霉素或乙醇预激活去核卵母细胞,对重组胚的卵裂和发育无明显影响。

阿拉伯马染色体G带核型分析

为了比较阿拉伯马与普通马的差异,利用培养的阿拉伯母马体细胞,制备和分析了其染色体组型。试验采用体外培养的阿拉伯马成纤维细胞,用常规染色体标本制作技术,制备了阿拉伯马染色体G带,并完成了染色体组型配对分析。结果显示阿拉伯马染色体数目为2n=64,包括31对常染色体和1对XX性染色体。其中1~13号染色体为中或亚中着丝粒染色体,14~31号染色体为端着丝粒染色体,X染色体则为第2对大亚中着丝粒染色体。G带核型显示阿拉伯马染色体G带明暗相间,每对染色体都有独特的带纹特征。本研究是首次在国内报道阿拉伯母马染色体G带特征。这将为阿拉伯马细胞遗传学研究和疾病诊断提供资料,也将为认识阿拉伯马与普通马的不同提供细胞水平的依据。

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞，Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法，也可以得到皮肤的原代培养细胞。２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织，可获得足够原代培养的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法，经２～３代后，可获得纯化的成纤维细胞。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。胎儿和皮肤成纤维细胞可分别传至第１３代与第１１代，传代后染色体数目不变。

用免疫手术及胚泡注射法产生小鼠嵌合体

用免疫手术的方法分离白色(昆明白)或棕色[昆明白×C57BL/6N)F_1,自交20代以上]小鼠胚泡的内细胞团,通过显微注射术将分离出的内细胞团,注入另一品系(棕色或白色)小鼠胚泡的胚泡腔内,经体外培养后移植到假孕受体子宫内,生下了嵌合体小鼠。共注射受体胚泡137枚,注射后成活121枚,成活率为88.3％(121/137),将98枚成活的胚泡移植到14只同步假孕受体小鼠子宫,移植后成活受体11只,其中7只受体受胎,受胎率为63.6％(7/11),7只受胎的受体小鼠,共接受胚胎49枚,产仔鼠30只,产仔率为61.2％(30/49)。到目前为止共存活14只仔鼠,仔鼠存活率为46.6％(14/30)。在9只已生长出毛的仔鼠中,2只仔鼠属于毛色嵌合,新生仔鼠中另2只仔鼠的眼睛颜色与供体胚的品系相同。眼球与其它组织的嵌合性,待进一步分析,免疫手术可以快速准确地得到大量的纯内细胞团,这种方法与胚泡注射法相结合,为制备动物嵌合体提供一条有效的新途径。

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。

不同激活方法对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响(简报)

哺乳动物体细胞核移植在家畜品种改良、濒危珍稀动物保护以及生物学、医学等基础科学研究和应用中越来越显示出其重要的作用。自Wilmut等首次用成年动物体细胞作供体,获得第一只成年体细胞克隆绵羊“Dolly”以来,世界各国科学家进行了大量深入的研究,已在小鼠、牛、猪、山羊等家畜上获得了成功。而且。

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．

人骨髓单核细胞表面分化抗原CD14基因的扩增、克隆和鉴定

根据人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４（ｈＣＤ１４）基因的核苷酸序列，设计ｈＣＤ１４基因５＇端和３＇端的两个引物．以人血中提取的基因组总ＤＮＡ为模板，利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术特异性扩增该基因１２４５加的编码序列．扩增产物经Ｘｂａｌ、ＫｐｎⅠ双酶切后，克隆到ｐＵＣ１８质粒ＸｂａＩ－ＫｐｎＩ位点间，随后转化大肠杆菌ＪＭ１０９．用ＰＣＲ方法筛选出重组菌落．经酶切和序列分析方法检测后，证明获得了含ｈＣＤ１４基因的重组克隆ｐＨＣＤ１４．巳测出的插入片段５＇端部分中包含着人ＣＤ１４基因４８８ｂｐ的序列，与巳报道的相应ＤＮＡ序列相比具有９９％的同源性．