猪CREBRF基因生物信息学和表达规律分析

CREBRF基因在雌性动物生殖过程中具有重要调控作用,为了深入了解猪的CREBRF基因特征和功能,对CREBRF基因进行生物信息学分析,并通过RT-qPCR分析不同阶段巴马猪卵巢组织中CREBRF的表达规律。结果显示,在5个品种猪基因组上鉴定到20个CREBRF基因的碱基突变,其中7个为同义突变,13个为错义突变。猪CREBRF基因的CDS区全长1920 bp,共编码639个氨基酸,不稳定系数较高,为亲水性蛋白,有85个高置信度的磷酸化位点和4个糖基化位点,且CREBRF的mRNA具有20个高可信度的m6A甲基化修饰位点,猪、人和小鼠中的CREBRF蛋白保守性较强。RT-qPCR结果显示,猪卵巢中CREBRF基因的表达量在猪出生0和28 d时表达水平较高,随着猪生长发育,在出生180 d时表达量显著降低,在母猪妊娠38和80 d时CREBRF的表达再次升高。通过比对不同品种猪中CREBRF基因CDS区的碱基突变并分析该基因的理化性质及表达规律,发现了CREBRF基因在猪胎儿期、出生早期和妊娠期卵巢组织中的高表达,推测CREBRF在母猪生殖过程中起重要作用,为猪高繁殖力基因挖掘和分子标记开发提供参考。

非洲猪瘟病毒O174L蛋白的真核表达载体构建及分子特征分析

为分析非洲猪瘟病毒O174L基因,通过同源重组方式将O174L基因连接至p RK5M-C-2×Strep载体,构建重组质粒,经PCR扩增和测序鉴定正确后,将重组质粒转染至猪小肠上皮细胞系(porcine intestinal columnar epithelial cells,IPEC-J2)中,通过免疫荧光和Western blot检测O174L蛋白的表达情况。PCR及测序结果显示,p RK5M-C-2×Strep-O174L重组质粒构建成功。免疫荧光和Western blot检测结果显示,O174L蛋白能够在IPEC-J2细胞中稳定表达。生物信息学分析结果显示,基于O174L基因和B646L(p72)基因序列构建各分离毒株的2个系统发育树间排列高度相似。来自中国的16株分离株中,O174L基因序列的相似性高达96.76%~100.00%。其中,与中国爆发的其他Ⅱ型分离株相比,China/2018/Anhui XCGQ在O174L蛋白的第67、75及110位氨基酸存在差异,GZ201801在第110位氨基酸存在差异。Ⅰ型分离株SD/DY-I/2021和HeN/ZZ-P1/2021的O174L蛋白的氨基酸序列分别在第13、73、93、95、113和114位上与其他中国Ⅱ型分离株存在差异。O174L蛋白为稳定的亲水蛋白,没有信号肽和跨膜区;其二级结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成,三级结构预测结果与二级结构预测相符。以上结果为深入研究ASFV O174L蛋白与宿主间的相互作用和遗传进化提供了基础。

基于CRISPR/Cas9技术建立IGF2R基因修饰PK-15细胞

作为我国特色的地方种质资源,藏猪对高海拔、低氧、强紫外线辐射等恶劣环境具有良好的适应性,前期研究发现藏猪的IGF2R(insulin-like growth factor 2 receptor,IGF2R)基因在其内含子上有1段274 bp的缺失,且该缺失为藏猪独有的变异,关于IGF2R是否参与藏猪对低氧等恶劣环境的适应性调节的相关研究尚未报道。为了建立IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,研究IGF2R基因对藏猪低氧耐受特性的影响,通过CRISPR/Cas9技术建立基因修饰PK-15细胞系,并通过PCR、实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western-blot)、免疫荧光(immunofluorescence,IF)等方法鉴定其分子特征,随后分别利用CCK-8和RT-qPCR、Western-blot对基因修饰细胞进行活力和凋亡基因检测。结果显示,已成功构建IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,IGF2R基因表达量极显著下调(P<0.01)。基因修饰细胞活力在72 h时极显著上升(P<0.01),并且含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase9)和BCL-2关联X(BCL2-associated X,BAX)蛋白的水平显著下调(P<0.05),并且B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL2)基因的mRNA水平极显著上升(P<0.01)。成功构建了IGF2R基因精确修饰的PK-15细胞系,并初步进行了功能研究,为研究IGF2R基因功能提供细胞模型,并为后续基因编辑猪的制备奠定基础。