减毒鼠伤寒沙门菌作基因递呈载体的体外试验

目的 体外情况下验证鼠伤寒沙门菌作为基因递呈载体 ,将基因转染入真核细胞的能力 .方法 构建增强绿色荧光蛋白 (EGFP)真核表达载体 pc DNA3.1(+) / EGFP,将重组 pc DNA3.1(+) / EGFP质粒和 pc DNA3.1(+)空载体用电穿孔法分别转入减毒鼠伤寒沙门菌 .分别用 2种重组细菌体外情况下感染小鼠腹腔灌洗巨噬细胞 ,培养 4 8h后 ,流式细胞仪检测两组小鼠巨噬细胞荧光强度 ,验证鼠伤寒沙门菌作为基因递呈载体的能力 .结果 成功构建了 pc DNA3.1(+) /EGFP重组鼠伤寒沙门菌 ;感染细胞培养 4 8h后 ,流式细胞仪检测表明 pc DNA3.1(+) / EGFP重组减毒鼠伤寒沙门菌感染的小鼠巨噬细胞荧光细胞百分比为 4 0 .6 % ,荧光强度为0 .92 7,均明显高于对照组 (分别为 3.8% ,0 .345 ,P<0 .0 1) .结论 减毒鼠伤寒沙门菌是一种有效的基因递呈工具 ,可将外源基因转入真核细胞并在其中表达 ,为进一步应用其研制口服 DNA疫苗奠定了基础 .

基于胃癌MG7-Ag模拟表位基因疫苗的构建

目的 构建以胃癌 MG7- Ag模拟表位为基础的DNA疫苗 .方法 将 H ind 酶切位点、MG7- Ag模拟表位和通用性辅助性 T细胞 (Th细胞 )表位编码序列的反向互补序列顺次设计于下游引物中 ,通过 2次聚合酶链式反应将 2种表位连接于一段载体基因 ,H ind 酶切位点位于载体片段与表位基因之间 .将目的基因插入 p UCm - T载体 ,酶切鉴定和序列测定证实后 ,利用 p UCm- T载体和 pc DNA3.1(+)载体共有的 Kpn 和 Xba 酶切位点 ,将目的基因亚克隆入真核表达载体 pc DNA3.1(+)载体 .酶切鉴定后 ,利用目的基因和pc DNA3.1(+)载体上的 H ind 酶切位点 ,H ind 酶切去除载体基因片段 ,得到胃癌 MG7- Ag模拟表位和通用性 Th细胞表位的真核表达载体 .结果 经序列测定证实 :PCR产物为载体基因、H ind 酶切位点、MG7- Ag模拟表位及通用性Th细胞表位的融合片段 ;最终得到的重组 pc DNA3.1(+)质粒含有正确编码以上 2种表位的基因片段 .结论 以胃癌MG7- Ag模拟表位为基础的 DNA疫苗构建成功 。

Ss-A/Ro核蛋白60 ku亚单位在胃癌多药耐药中的作用

目的:对Ro 60在胃癌多药耐药中的功能进行研究．方法:克隆Ro 60编码基因,构建Ro 60编码基因的正义真核表达载体,将其转导入SGC7901 细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素．结果:成功构建了Ro 60正义真核表达载体, 应用脂质体介导法将其转导入SGC7901,Ro 60真核表达载体转染SGC7901细胞后其表达量明显增加,体外药物敏感性试验提示其对长春新碱、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、阿霉素的敏感性减低,SGC7901细胞的IC50值 (mg/L)与未转染细胞和转染空白载体细胞相比,显著增加(2．28±0．11 vs 0．45±0．04,0．65 ±0．05;2．89±0．14 vs 0．61±0．21,0．90±0．11; 1．92±0．03 vs 0．54±0．03,0．75±0．21;1．41± 0．06 vs 0．45±0．03,0．54±0．03;0．28±0．03 vs 0．14±0．01,0．14±0．01;均P<0．01),细胞内阿霉素蓄积显著减少(56．30±2．49 mg/L vs 92．83 ±3．63,87．38±2．94 mg/L,P<0．01)．结论:Ro 60真核表达载体转染SGC7901细胞后显示了一些多药耐药的特性,提示Ro 60在胃癌多药耐药中发挥了一定的作用．

趋化因子受体CXCR3在胃癌中的表达

背景近年来,趋化因子及其受体在肿瘤转移中的作用引起了重视,但有关趋化因子受体CXCR3在胃癌中的表达尚无报道。目的检测胃癌组织和细胞系中CXCR3在mRNA和蛋白水平的表达,为进一步研究其在胃癌转移中的作用奠定基础。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT鄄PCR)检测胃癌细胞系CXCR3mRNA的表达,蛋白质印迹法(Westernblotting)检测胃癌组织和细胞系CXCR3蛋白的表达,流式细胞仪检测胃癌细胞系表面CXCR3的表达。结果在所检测的胃癌组织中,CXCR3蛋白的表达量明显高于相应癌旁组织。所检测的胃癌细胞系均有CXCR3mRNA和CXCR3蛋白表达,但仅KATOⅢ细胞表面CXCR3的表达较明显。永生化胃上皮细胞系GES鄄1的CXCR3蛋白表达量明显低于胃癌细胞系。结论胃癌细胞系有CXCR3表达,胃癌组织中CXCR3的表达高于癌旁组织。

电压门控钾通道Kv1.5反义核酸对胃癌细胞SGC7901生长的抑制作用

目的 构建电压门控钾通道Kv1 5分子的反义核酸 (Kv1 5AS)的真核表达载体 ,建立Kv1 5AS转染的胃癌SGC790 1细胞亚系 ,探讨Kv1 5分子对胃癌细胞生长的抑制作用。方法 通过DNA重组技术 ,将Kv1 5全长cDNA片段从 pBK Kv1 5载体反向亚克隆至真核表达载体pcDNA3 1 ,构建表达Kv1 5反义核酸的重组载体 pcDNA3 1 Kv1 5AS。借助脂质体将pcDNA3 1 Kv1 5AS转导入胃癌细胞SGC790 1。通过MTT实验绘制细胞生长曲线 ,肿瘤细胞集落形成实验检测集落形成率 ,流式细胞仪进行细胞周期分析 ,并利用Westernblot检测Kv1 5和CyclinD1蛋白在基因转染细胞中的表达。结果 限制性酶切鉴定结果提示 ,重组载体 pcDNA3 1 Kv1 5AS构建成功。Westernblot结果表明 ,转染pcDNA3 1 Kv1 5AS后 ,Kv1 5蛋白在SGC790 1细胞中的表达显著降低。与转染空载体的对照细胞相比 ,转染Kv1 5AS表达载体后 ,SGC790 1细胞生长变缓 ,集落形成率显著降低 ,细胞发生了G1 期阻滞。Westernblot结果证实 ,CyclinD1蛋白在Kv1 5AS转染细胞中表达降低。结论 电压门控钾通道Kv1 5反义核酸可抑制胃癌细胞SGC790

KAI1基因在肝硬化和肝细胞癌组织中的表达及其意义

目的研究转移抑制基因KAI1在肝硬化和肝细胞癌组织中的表达及该基因与肝细胞癌患者临床资料间的关系。方法采用Northern blot方法研究20例肝细胞癌组织、14例肝硬化组织和10例正常肝组织中KAI1基因mRNA的表达水平,经mRNA的定量分析及统计处理判定KAI1基因与肝细胞癌患者临床特征的关系。结果肝硬化和肝细胞癌组织中KAI1 mRNA表达水平(0.113±0.110;0.139±0.078)显著低于正常肝组织中的表达(0.316±0.121),(P=0.0003;P=0.0000);肝硬化和肝细胞癌组织中KAI1基因mRNA的表达无显著差异(P=0.4152);KAI1mRNA在不同分化程度的肝细胞癌组织中的表达无显著差异(P=0.8261),而Ⅲ期肝细胞癌组织中的KAI1基因表达显著低于Ⅱ期的肝细胞癌组织(P=0.0221)。结论转移抑制基因KAI1在肝硬化阶段亦有低表达;肝癌组织中KAI1基因的低表达与肝癌的转移有关。

Notch4在溃疡性结肠炎中的表达与分析

目的研究Notch4在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)中的表达、分布及意义。方法收集50例UC患者病变部结肠组织及32例结肠癌患者术后大体标本两端的正常黏膜组织。用免疫组化方法检测Notch4在50例UC及32例对照结肠黏膜组织中的表达情况。结果Notch4在UC患者结肠组织及对照的正常结肠组织中均有表达,两者之间的差异无统计学意义(P>0.05)。Notch4的表达与UC患者的性别、年龄及UC病变程度无统计学意义(P>0.05)。结论Notch4在UC患者结肠黏膜组织与正常结肠黏膜组织中的表达相似,差异无统计学意义。

表达胃癌MG7-Ag模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗的研制和初步鉴定

目的 研制可表达胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗。 方法将ＮｃｏⅠ位点和ＭＧ７－Ａｇ模拟表位编码序列的互补序列设计到上游引物的５′端。以含有ＨＢｃＡｇ全序列的质粒ｐ１．２Ⅱ为模板，通过ＰＣＲ扩增，获得ＭＧ７－Ａｇ模拟表位与ＨＢｃＡｇ的融合基因。将目的基因插入载体ｐＵＣｍ－Ｔ，经酶切鉴定和序列测定证实后，再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０互补的质粒ｐＹＡ３３４１中，再以此重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０。结果序列测定证实，ＰＣＲ产物为胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位与ＨＢｃＡｇ的融合基因片段；最终得到含有目的基因片段的重组表达载体ｐＹＡ３３４１。重组质粒在Ｘ４５５０中的表达产物，经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明，在相对分子质量（Ｍｒ）约在２２ ０００处有１条可与抗ＭＧ７ ｍＡｂ特异性结合的多肽表位。结论成功地研制可表达胃癌ＭＧ７－Ａｇ模拟表位减毒鼠伤寒杆菌疫苗，为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。

Ss-A／Ro核蛋白60 ku亚单位及其变异体在耐药胃癌细胞中的表达

目的:克隆Ss-A／Ro 60 ku亚单位编码基因,检测Ss-A／Ro 60 ku亚单位及其变异体在耐药胃癌细胞中的表达情况．方法:应用RT-PCR克隆Ss-A／Ro 60 ku亚单位编码基因,应用半定量RT-PCR检测Ss-A／Ro 60 ku亚单位及其变异体在胃癌细胞中的表达情况．结果:成功克隆了Ss-A／Ro 60 ku亚单位编码基因,并发现了他的两种变异体,长度分别为52 bp和41 bp．半定量RT- PCR结果显示,Ss-A／Ro 60 ku亚单位在SGC7901／VCR中的表达强度高于SGC7901细胞(P=0．0001),Ss-A／Ro 60 ku亚单位的两种变异体在SGC7901／VCR中的表达强度也高于 SGC7901细胞(P=0．001)．结论:Ss-A／Ro 60 ku亚单位及其两种变异体为胃癌多药耐药相关分子．

利用细菌内重组腺病毒系统构建胃癌MG7-Ag模拟表位疫苗

目的:以复制缺陷的腺病毒为疫苗载体,构建基于胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒疫苗.方法:将编码MG7-Ag模拟表位的互补序列设计到上游引物的5/端.以含有HBcAg全序列的质粒p1.2Ⅱ为模板,通过PCR扩增,获得MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因.经序列测定证实后,亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组.经抗性筛选及酶切鉴定的重组质粒,再用导入293细胞进行包装,利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达.结果:序列测定证实,PCR产物为胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片段;酶切鉴定表明胃癌MG7-Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片断插入了pAdTrack-CMV穿梭质粒,卡那霉素进行抗性筛选及PacⅠ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.PacⅠ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论:胃癌MG7-Ag模拟表位的重组腺病毒载体的构建成功,为进一步研究胃癌MG7-Ag模拟表位诱发抗胃癌免疫打下了基础.

Runx3在溃疡性结肠炎中的表达

目的:观察Runx3在溃疡性结肠炎(UC)粘膜组织中的表达,探讨抑癌基因RUNX3在溃疡性结肠炎发病机制中的调控作用。方法:选取经过临床表现、内镜、病理等方法共同确诊的溃疡性结肠炎活检的石蜡标本和结肠癌手术切除标本残端的正常组织石蜡标本,用免疫组织化学的方法检测Runx3蛋白在68例UC及50例对照结肠粘膜组织中的表达情况。结果:Runx3在UC及对照组结肠粘膜组织中均有表达,两者之间的差异无统计学意义(P>0.05)。Runx3的表达与UC患者的性别、年龄及病变严重程度之间无显著性相关(P>0.05)。结论:Runx3作为一个转录因子在溃疡性结肠炎的发病机制中可能通过非直接的方式发挥其重要作用。

MGr1-Ag表达上调及下调的胃癌细胞株的建立及鉴定

为研究胃癌细胞耐药相关新基因MGr1 Ag对胃癌耐药细胞多药耐药性的调节作用及其机制。克隆MGr1 Ag的全长cDNA并构建其正反义真核表达载体 ,以脂质体介导法将正、反义真核表达载体分别转染入人胃癌细胞系MGC80 3与人胃癌多药耐药细胞系SGC790 1/VCR中。结果显示 ,经RT PCR扩增出大小约为 1.0kb的基因片段 ,成功克隆入pUCm T载体 ,经DNA测序证实为MGr1 Ag基因。将其克隆入pCDNA3 .1/V5 His后 ,经限制性核酸内切酶酶切鉴定 ,获得携有MGr1 Ag基因真核表达载体pCD NA3 1/V5 His MGr1 Ag及其反义表达载体pCDNA3 .1/V5 His anMGr1 Ag。以脂质体介导法将MGr1 Ag的正、反义真核表达载体分别转染入MGC80 3与SGC790 1/VCR中 ,经Westernblot证实 ,成功建立了MGr1 Ag表达上调及下调的胃癌细胞株 ,为研究MGr1

难治性克罗恩病的治疗进展

本文简介了难治性克罗恩病的概念和各种药物的治疗进展,以及干细胞移植术的临床应用等,对难治性克罗恩病的治疗具有指导意义。

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的 :构建α1,3 半乳糖基转移酶的重组真核表达质粒 pcDNA3.1/V5 HisAα1,3GT ,为进一步利用其进行胃癌的基因治疗奠定基础 .方法 :从BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA ,行RT PCR扩增出编码α1,3 半乳糖基转移酶的全长cDNA ,并克隆入pUCm T测序载体 .经DNA测序证实序列无误后 ,将α1,3 半乳糖基转移酶基因片段亚克隆入pcDNA3.1/V5 HisA真核表达载体 .结果 :经RT PCR扩增出大小约为 1.2kb的基因片段 ,成功克隆入pUCm T载体 .经DNA测序证实为α1,3 半乳糖基转移酶 (α1,3 galactosyl transferase,3GT) ,大小为 12 2 1bp ,编码序列及读框均正确 .经亚克隆酶切鉴定 ,获得携有α1,3GT基因的重组质粒pcD NA 3.1/V5 HisAα1,3GT .结论 :成功地构建α1,3GT真核表达载体 。

消化内科临床教学的几点体会

消化内科实习是内科临床教学实践中的一个重要组成部分,探讨消化内科的临床教学,对于加强实习学员基本技能的训练,开拓临床思维能力,培养良好的职业道德,指导学员顺利完成实习工作具有重要意义。本文针对消化内科实习教学常见的问题,就如何加强教学管理,提高教学质量,提出了相关解决方法和一些实践经验。

腹腔灌洗引流在重症急性胰腺炎非手术治疗中的作用——附104例随机对照研究

目的探讨腹腔灌洗引流在SAP非手术治疗中的作用。方法104例SAP患者随机分为腹腔灌注组（n=45）和腹腔未灌注组（n=59）,腹腔未灌注组给予常规胃肠减压、抑酶等非手术治疗,腹腔灌注组在常规治疗基础上加腹腔灌洗引流。观察两组疗效、并发症发生率以及平均住院天数,按BalthazarCT分级标准和Ranson标准评分。结果两组治愈率和好转率比较无显著差异（P〉0.05）,但腹腔未灌注组病死率（15.3%）显著高于腹腔灌注组（P〈0.01）。死因多数由于严重并发症,如感染并发ARDS、MODS和DIC等。两组治愈病例的CT分级和Ranson分值无显著性差异,但两组好转病例CT分级均显著高于治愈病例（P〈0.01）。两组治愈或好转病例治疗后的Ranson分值均显著低于入院时（P〈0.01）。腹腔灌注组弥漫性腹膜炎、低血容量性休克、急性肾衰、Ⅱ型呼衰、ARDS和MODS的并发症发生率显著低于腹腔未灌注组（P〈0.01或P〈0.05）。腹腔灌注组治愈和好转病例平均住院天数为（21.7±10.1）d和（30.3±19.9）d,显著短于腹腔未灌注组的（35.3±16.2）d和（41.1±22.6）d（P〈0.01）。结论腹腔灌洗引流术是一种安全有效的SAP辅助治疗方法,在非手术治疗基础上行腹腔灌注的疗效明显优于单纯非手术治疗,可以减少严重并发症的发生率,降低病死率。

物理诊断学教学中多媒体教学的应用体会

多媒体辅助教学在物理诊断学教学中已经得到广泛应用,具有明显优势。在应用多媒体技术过程中,有几个方面需要注意,首先课前准备要充分,比传统教学有更高的要求。其次,课堂上要避免完全依赖多媒体,还需要与传统教学手段有机结合,要有利于学生的课后复习。另外,设备的保养维护也十分重要。

硫氧化还原蛋白对胃癌细胞化疗敏感性的调节作用

目的 探讨硫氧化还原蛋白 (Trx)对胃癌细胞化疗敏感性的调节作用。方法 通过RT PCR从人胃癌耐药细胞系SGC790 1/VCR细胞中克隆Trx全长cDNA ,构建Trx正反义真核表达载体 ,并借助脂质体将正义载体转入胃癌细胞SGC790 1、反义载体转入胃癌耐药细胞SGC790 1/VCR ,利用MTT试验在体外检测基因转染细胞及其对照细胞对化疗药物的敏感性。结果 转染Trx正义载体后 ,SGC790 1细胞对长春新碱、顺铂、阿霉素的敏感性显著降低 ;转染Trx反义载体后 ,SGC790 1/VCR细胞对长春新碱、顺铂、阿霉素的敏感性显著升高。结论 Trx可能参与了胃癌细胞多药耐药性的形成 。

环氧合酶-28473 T/C位点基因多态性与中国汉族人群溃疡性结肠炎易感性的相关性研究

背景:溃疡性结肠炎(UC)是由环境、感染、免疫、遗传等多因素相互作用所致的肠道慢性炎症,其中遗传易感性可能在UC的发病中起重要作用。目的:了解中国汉族UC患者环氧合酶(COX)-23’非翻译区8473T/C位点基因多态性及其与UC发病的可能相关性。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对291例UC患者和286名健康对照者的COX-23’非翻译区8473T/C位点的单核苷酸多态性进行检测。结果:与健康对照组比较,UC组COX-28473T/C位点TT基因型频率较低(58.8%对64.3%),而TC、CC基因型频率较高(36.8%对33.9%、4.5%对1.7%),但差异均无统计学意义(P>0.05)。两组受检者T等位基因频率均较高,两组间C等位基因频率差异无统计学意义(P=0.092)。结论:COX-23’非翻译区8473T/C位点基因多态性与中国汉族UC患者的遗传易感性无相关性。

Id1真核表达载体的构建及胃黏膜上皮细胞系的转染

目的 :扩增Id1基因 ,构建Id1真核表达载体pcD NA3.1 /V5HisA Id1 .方法 :以胃癌细胞SGC790 1cDNA为模板 ,以Id1基因编码区外的两段特异性序列为引物 ,获得Id1基因的全长 .将目的基因插入载体pUCm T ,经序列测定证实后 ,亚克隆至pcDNA3.1 /V5HisA并经酶切鉴定 .采用脂质体转染的方法将重组质粒稳定转染至胃粘膜上皮永生化细胞系GES 1中 .结果 :经RT PCR方法扩增出大小为 6 0 8bp的基因片断 ,序列测定其编码序列及读框正确 .亚克隆经酶切鉴定正确 .经过 8wkG4 1 8筛选后 ,获得稳定表达Id1的细胞亚系 .经Westernblotting证实 ,Id1蛋白表达水平高于对照组 .结论 :成功地构建了Id1真核表达载体 。