人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

目的:克隆人CXCR3B基因,并构建含有该目的基因的真核表达载体,获得稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B。方法:采用PCR方法从pMD19-T/huCXCR3A质粒中扩增人CXCR3B基因,通过双酶切装入真核表达载体pIRES2-EGFP中;脂质体法转染L929细胞,G418加压筛选阳性克隆;分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中人CXCR3B在mRNA和蛋白水平的表达。MTT分析基因转染细胞株L929-huCXCR3B在Mig(monokineinduced by IFN-γ,IFN-γ诱导的单核因子)作用下的增殖能力。结果:成功克隆了人CXCR3B基因并构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/huCXCR3B,转染该载体后获得了稳定表达人CXCR3B的基因转染细胞株L929-huCXCR3B,膜表面CX-CR3B分子的阳性表达率为93%。该基因转染细胞与其配体Mig共培养24、48及72 h,抑制率分别为41.44%、44.01%和24.80%。结论:L929-huCXCR3B细胞株的建立为研究CXCR3B信号转导及制备相应的单克隆抗体(mAb)奠定了基础。

转染小鼠CXCR3基因的B16-mCXCR3细胞在体内外迁移和致瘤作用研究

目的:建立稳定表达小鼠CXCR3基因的B16细胞株,研究CXCR3分子在肿瘤形成及转移过程中的作用。方法:采用PCR方法从pMD19-T/mCXCR3质粒中扩增CXCR3基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染小鼠黑色素瘤细胞B16;G418加压筛选阳性克隆,分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中CXCR3在mRNA和蛋白水平的表达。采用Transwell系统检测B16-mCXCR3细胞在其配体IP-10介导下的迁移能力。将B16-mCXCR3细胞分别通过皮下和眼静脉注射接种于BALB/c小鼠,观察在小鼠体内的成瘤率及肿瘤转移情况。结果:构建了表达小鼠CXCR3基因的真核表达载体pIRES2-EGFP/mCXCR3,转染该载体后获得了稳定表达CXCR3的B16-mCXCR3细胞。B16-mCXCR3细胞(1×105个),在20μg/L IP-10作用下迁移的细胞数为3 208个,与B16组和B16-mock组相比均具有统计学意义(P<0.01)。于小鼠皮下接种B16-mCXCR3细胞、B16细胞和B16-mock细胞,第20天成瘤率均为100%。于小鼠眼静脉注射B16-mCXCR3细胞,第21天时50%的小鼠在肺部出现肉眼可见的黑色肿瘤转移灶,B16细胞组和B16-mock细胞组肺部未见肿瘤转移灶,B16-mCXCR3组与B16组和B16-mock组相比均具有统计学意义(P<0.01)。结论:转染CXCR3基因的B16-mCXCR3细胞,在IP-10介导下可定向迁移,并可增加在小鼠体内的转移率。

B7-2基因工程抗体的制备及体内外抗B淋巴瘤作用研究

构建B7-2人-鼠嵌合抗体基因表达质粒pIRES/ch3C8,经脂质体法转染真核表达细胞株CHO制备B7-2人-鼠嵌合抗体(命名为ch3C8)。该抗体能够识别人恶性B淋巴瘤细胞株Raji表面的B7-2分子并诱导其凋亡。ch3C8结构中来源于人Ig的Fc段可介导高效的ADCC及CDC效应。经ch3C8结合的Raji细胞接种于BALB/c裸鼠后的致瘤性消失。该抗体在B7-2相关肿瘤的生物治疗中具有潜在的应用价值。

人CXCR3基因转染细胞株的构建、鉴定及初步功能研究

目的:构建含有人CXCR3基因的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达人CXCR3分子的基因转染细胞株L929-CXCR3,研究CXCR3与其配体Mig、IP-10及I-TAC相互作用引起的L929-CXCR3的迁移效应。方法:TRIzol一步法从经PHA和IL-2活化的人PBMC中抽提总RNA,RT-PCR扩增人CXCR3全长基因,装入逆转录病毒载体pEGZ-term,与两辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T,收集培养上清感染L929细胞,500μg/mlzeocin加压筛选获得稳定表达人CXCR3分子的基因转染细胞株L929-CXCR3。采用流式细胞术和RT-PCR分别从蛋白及基因水平对CXCR3的表达进行鉴定。Transwell分析L929-CXCR3细胞在Mig、IP-10及I-TAC作用下的迁移率。结果:构建了含人CXCR3基因的重组逆转录病毒载体,建立了人CXCR3基因转染细胞株L929-CXCR3,其膜表面CXCR3分子的阳性表达率为98.4%;趋化L929-CXCR3发生迁移的最小配体浓度分别为Mig10ng/ml、IP-105ng/ml及I-TAC1ng/ml,相应迁移率分别为2.46%、2.34%及2.24%。结论:L929-CXCR3细胞株的建立为研究CXCR3信号转导与生物学功能及制备相应的单克隆抗体奠定了基础。

抗人CD80单链抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人CD80单链抗体(ScFv),并初步研究其生物学功能。方法:采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80mAb的杂交瘤细胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,并亚克隆至pIRES2-EGFP表达载体,脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压筛选。纯化抗CD80-ScFv,并分析其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗CD80-ScFv与相应抗原的结合能力。MTT法体外分析抗CD80-ScFv对CD80介导的共刺激信号的阻断作用。结果:构建的抗CD80-ScFv基因全长为828 bp,经测序含有信号肽和连接肽。实验获得稳定表达细胞株SA-Ⅱ,其培养上清与L929-CD80细胞的阳性结合率达98%以上。抗体纯化后产率约为15.12 mg/L,其能够识别Raji和Daudi细胞天然表达的CD80分子,结合率分别为96.6%和95.0%。抗CD80-ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98.67%,并能阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。结论:成功建立了抗CD80-ScFv CHO细胞的表达株(命名为SA-Ⅱ),该抗体能够特异识别细胞表面膜型CD80分子并介导相应的生物学功能。

小鼠CXCR3基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

目的：构建含有小鼠CXCR3基因的重组逆转录病毒载体，获得稳定表达小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-mCXCR3，研究CXCR3与其配IP-10相互作用引起的L929-mCXCR3的迁移效应。方法：取1只雌性BALB／c小鼠（7周龄），尾静脉注射0．5mgConA／只，12h后取其脾脏，研磨成细胞悬液后，分离获得脾脏细胞；用含5万U／L人IL-2的RPMll640培养基培养3d；收集细胞，TRIzol一步法抽提总RNA，RT—PCR扩增小鼠CXCR3全长基因，装入逆转录病毒载体pEGZ—term，与两辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T，收集含完整逆转录病毒颗粒的293T培养上清感染L929细胞，重复感染3次，筛选获得含Zeocin抗性的稳定表达小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株。采用流式细胞术（FCM）和RT—PCR对CXCR3分子的表达进行鉴定。Transwell分析基因转染细胞株L929-mCXCR3在IP．10作用下的迁移能力。结果：构建了含小鼠CXCR3基因的重组逆转录病毒载体，建立了稳定表达小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-mCXCR3，其膜表面CXCR3分子阳性表达率为97．0％；该基因转染细胞株在IP-10的介导下可定向迁移，迁移率为4．356％。结论：L929-mCXCR3细胞株为研究CXCR3信号通路的生物学特性、肿瘤转移模型的建立和抗小鼠CXCR3单克隆抗体的研制奠定了基础。

siRNA沉默抗原递呈细胞表面CD86的表达对T淋巴细胞激活的影响

目的:通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC)表面共刺激分子CD86的表达,分析其对T细胞增殖和白介素10及IFNγ-分泌的影响,为移植排异和自身免疫性疾病的治疗提供新的思路和方法。方法:设计并通过化学方法合成三对针对人CD86 mRNA的siRNA片段(siRNA-1、2、3),脂质体法转染人B淋巴瘤Raji细胞;转染24、48、72小时后,流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测Raji细胞表面CD86蛋白水平的表达;荧光定量PCR方法检测CD86mRNA水平的表达;分别采用siRNA抑制Raji细胞表面CD86分子的表达、抗人CD86单克隆抗体封闭CD86分子以及二者的联合来阻断CD86-CD28信号通路、MTT和ELISA方法分别检测CD86信号通路被抑制后对T细胞增殖和细胞因子IL-10及IFNγ-分泌的影响。结果:FCM结果显示,Raji细胞表面天然表达CD86的阳性率约为98.0%;转染siRNA后24小时时,仅siRNA-2组表现较为明显的抑制效应,此时细胞表面CD86的阳性表达率约为61.7%,抑制率为37.0%;转染后48小时,control和siRNA-1组Raji细胞表面CD86的表达仍没有变化,而siRNA-2组CD86的表达下降至39.6%,抑制率为59.6%,siRNA-3组CD86的表达下降至72.6%,抑制率为25.9%;siRNA转染后72小时,各组Raji细胞表面CD86的表达均有不同程度的变化,分别为:control组,90.4%;siRNA-1组,83.1%;siRNA-2组,15.2%和siRNA-3组,46.2%;各组的抑制率依次为7.6%,15.2%,84.5%及52.8%。荧光定量PCR结果显示,转染后72小时,仅siRNA-2和siRNA-3组CD86 mRNA水平的表达与Raji细胞相比有显著差异,抑制率分别为78.7%和45.9%。CD86的表达被siRNA-2抑制后,可抑制Raji细胞对T细胞的活化、增殖和IL-10及IFNγ-的分泌;抗人CD86单克隆抗体同样可以抑制Raji细胞对T细胞的激活;并且siRNA-2和抗人CD86单克隆抗体对T细胞的活化抑制具有协同效应。结论:通过siRNA沉默抗原递呈细胞表面共刺激分子CD86的表达,从而阻断CD86/CD28共刺激信号通路,可有效抑制T淋巴细胞的活化、增殖及细胞因子IL-10、IFNγ-的分泌,由此削弱了T细胞应答来诱导免疫耐受。

20个紫花苜蓿品种的ISSR遗传多样性分析

采用ISSR分子标记技术,对来自美国、加拿大、澳大利亚和荷兰等4个国家的20个紫花苜蓿品种进行遗传多样性和亲缘关系分析。结果显示：从100条ISSR引物中筛选出10条带型清晰、多态性较好的引物,共扩增出75条带,其中62条呈多态性条带,多态性比率（PPB）为82.67%。20个紫花苜蓿品种的遗传相似性系数为0.60~0.87,平均为0.75,其中Algonquin与Phabulous之间的遗传相似性最高,达0.87,Sanditi,WL232和4020品种间,以及32IQ和Sequel品种间的遗传相似性最低,均为0.60。UPGMA聚类分析结果可将20个紫花苜蓿品种划分为6大类群,充分说明其具有丰富的遗传多样性。

抗人CD28激发性单抗对T细胞淋巴瘤的抑制作用研究

目的:研究鼠抗人CD28单克隆抗体(克隆号:2F5)对T淋巴细胞瘤的抗肿瘤效应,为抗体介导肿瘤靶向治疗提供新的方法和思路。方法:流式细胞术检测鼠抗人CD28单克隆抗体2F5对人T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞表面膜型CD28分子的识别;MTT法检测2F5对Jurkat细胞体外增殖的影响;将Jurkat细胞株接种于裸鼠腋下,建立Jurkat细胞荷瘤裸鼠模型;经瘤内多点注射2F5(注射剂量1μg/mm3),逐日观察肿瘤的大小和裸鼠的生存状态。结果:2F5能够识别Jurkat细胞表面CD28分子,阳性结合率可达93.37%;2F5与Jurkat细胞共培养后,显微镜下观察可见胞质中出现黑色颗粒,胞膜破裂,细胞的折光性和立体感减弱;MTT法分析结果显示,抗CD28单抗对Jurkat细胞的体外增殖具有明显的抑制作用;将Jurkat细胞接种35只裸鼠(成瘤率达70%);经瘤内多点注射2F5,35天后荷瘤小鼠体内肿瘤的生长速率明显降低;而生理盐水对照组肿瘤生长无明显改变。结论:鼠抗人CD28单克隆抗体2F5通过与Jurkat细胞表面膜型CD28分子结合对其增殖具有明显的抑制作用,提示CD28分子可作为治疗T淋巴瘤的一个潜在靶点,抗体对治疗CD28分子阳性的肿瘤具有潜在临床应用价值。

鼠抗人CXCR3单克隆抗体的研制及生物学功能研究

目的:获得持续分泌鼠抗人CXCR3单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株;以鼠抗人CXCR3 mAb作为工具,研究人CXCR3分子的表达特性及CXCR3信号转导对L929-huCXCR3和结肠癌细胞株的迁移及增殖的影响。方法:以高表达人CXCR3膜型分子的L929-huCXCR3细胞作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交技术,将免疫小鼠的脾脏细胞与同种系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合。以L929-huCXCR3作为筛选细胞,转染空载体的L929-mock细胞作为阴性对照细胞,采用间接免疫荧光和流式细胞术,筛选能持续分泌抗人CXCR3 mAb的杂交瘤细胞株。采用Ig亚类快速定性试纸法和间接免疫荧光法对所获得的杂交瘤细胞株和mAb进行鉴定;用间接免疫荧光法分析CXCR3分子在肿瘤细胞表面的表达;Transwell隔离小室检测mAb对L929-huCXCR3和结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT29迁移的影响;MTT法分析mAb对结肠癌细胞株Colo205增殖的影响。结果:获得了1株能持续分泌鼠抗人CXCR3 mAb的杂交瘤细胞株,命名为9B5。经快速定性试纸分析显示,该mAb重链为IgG1亚类,轻链为链;间接免疫荧光和流式细胞术分析显示,mAb 9B5可识别活化T淋巴细胞和结肠癌细胞株Colo205、HCT116及HT29表面的CXCR3分子。通过阻断CXCR3信号转导,mAb 9B5可抑制L929-huCXCR3细胞和结肠癌细胞株Colo205、HCT116和HT29的定向迁移及IP-10对Colo205的促增殖作用。结论:成功获得了1株能持续分泌鼠抗人CXCR3 mAb的杂交瘤细胞株,为研究CXCR3的表达特性及深入探讨CXCR3信号转导在肿瘤生长与转移过程中的作用及机制奠定了物质基础,并且有望为治疗肿瘤转移提供新的思路和新型药物。

行政事业单位专项资金管理的问题及对策探讨

当前,财政体制改革的一个重要环节是深化行政事业单位财政支出管理改革,提高财政资金使用效益.而在整个财政支出中,最为重要的是对专项资金支出的管理.规范行政事业单位的专项资金核算,提高管理水平,对于增加财政专项资金使用效益,加强行政事业单位财务管理,强化行政事业单位的职能有着十分重要的意义.本文在分析行政事业单位加强专项资金管理的重要性基础上,深入探讨了当前行政事业单位专项资金管理存在的问题及其成因,并针对性地提出了加强行政事业单位专项资金管理的对策措施.

过量表达马蔺VP基因增强烟草抗旱耐盐性研究

干旱与土壤盐渍化已成为限制植物生长的重要影响因素。液泡膜H^+焦磷酸酶(V-H^+-PPase)具有质子泵功能,在植物抗旱耐盐中起重要作用。本研究将课题组得到的转马蔺IlVP(V-H^+-PPase)基因烟草植株(T3和T18)进行不同浓度NaCl处理和干旱胁迫,并以野生型烟草W38(WT)为对照,通过对其生长和生理指标的测定分析,结果显示,在NaCl或干旱处理下,转基因烟草T3和T18植株干重、叶面积、叶片相对含水量和水分利用效率均高于野生型WT植株,其中200mmol·L^(-1) NaCl处理下T18干重、叶面积、叶片相对含水量和水分利用效率分别是W38的2.46、1.69、1.08和3.84倍,干旱处理下T18的各项指标分别是野生型的1.52、1.17、1.07和1.41倍。转基因和野生型植株的叶片质膜透性均随NaCl浓度增加或干旱处理而有所升高,但转基因植株的增量明显低于野生型。转基因及野生型植株根、茎、叶中的Na^+含量均随NaCl浓度升高或干旱处理而增加,而K^+含量呈逐渐降低趋势,但转基因T3和T18烟草根、茎、叶中的Na^+和K^+含量均高于野生型WT。这说明NaCl和干旱胁迫下过量表达IlVP可增强烟草的液泡离子区域的能力,降低Na^+对细胞质的毒害,进而保护膜的完整性,提高烟草的抗旱性和耐盐性。

浅议行政事业单位“三公经费”内部控制

"三公经费"的使用与管理问题是公众关注和关心的焦点社会问题,长期以来备受诟病和质疑。新形势下行政事业单位如何解决"三公经费"的使用缺陷和存在问题是亟待落实的重点内容。本文在分析行政事业单位加强"三公经费"内部控制的重要性基础上,深入探讨了行政事业单位"三公经费"管理存在的问题及其成因,并从内控制度、内控执行、内控监督等方面,针对性地提出了完善行政事业单位"三公经费"内部控制的对策措施。

隔代教育对3～6岁幼儿社会性发展的影响

对滁州市两所幼儿园的关于隔代抚养、社会性发展等因素对幼儿的社会性行为产生的影响的考察结果表明:隔代教养幼儿的年龄和社会能力水平成显著性相关;不同层次教育水平的幼儿园中隔代教养幼儿的社会能力的各维度存在显著性差异。

产后出血142例临床护理体会

目的总结产后出血的病因和预防产后出血的护理措施。方法回顾性分析142例产后出血患者的资料。结果宫缩乏力、胎盘因素是产后出血的主要原因。结论加强产后2h内的观察护理,及时发现产后出血原因,及时采取有效的治疗护理,是减少产后出血,降低病死率的重要措施。

护理措施对预防医院感染的探讨

医院感染亦称医院获得性感染(hos-pital acquirel infertion,HAI)是指在医院内获得的一切感染,包括在住院期间已经出现以及住院期间获得而出院后出现的感染,但不包括入院时即有或已潜伏的感染。研究对象是指一切在医院活动过的人群,如患者,工作人员及陪护家属等等。它不仅增加患者痛苦,延长住院时间,增加医护人员工作量及患者额外经济负担,又给国家造成经济损失,故应采取有力措施,预防HAI。

沟通是构建和谐护患关系的桥梁

沟通是构建和谐护患关系的纽带,良好的护患沟通对于改善护患关系,提高服务质量,促进患者康复起着重要作用。

智能终端的最简情感表达

为了使用低自由度水平的执行器构建引起用户特定情绪感受的表达性模式,提出智能终端产品的最简情感表达方法,首先在统一的效价-唤醒度情感模型下对灯光、音乐、运动和振动4种低自由度执行器的情感表达能力进行分析;然后通过实验得出各执行器在不同的参数条件下可以表达的情感范围,以及执行器自由度水平的取值与用户所感受到的情感愉悦度、唤醒度的相关关系.在实验结果的基础上,设计与开发了一款最简情感表达设计辅助工具,用于辅助设计师在智能终端产品的设计研发过程中对产品的情感表达能力进行快速原型搭建.

护理措施对预防医院感染的探讨

医院感染亦称医院获得性感染（hos—pitalacquirelinfertion，HAI）是指在医院内获得的一切感染。研究对象是指一切在医院活动过的人群，如患者，工作人员及陪护家属等等。它不仅增加患者痛苦，延长住院时间，增加医护人员工作量及患者额外经济负担，又给国家造成经济损失，故应采取有力措施，预防HAI的发生。

浅论内部审计的独立性

内部审计的独立性是其发挥作用的根本保证。目前制约我国内部审计独立性的主要因素为法制因素、机构设置因素和人员配备因素等，针对这些因素在内部审计的法制建设、机构设置模式及工作方面等方面提出了具体的措施和建议。