过表达miR-378a修饰骨髓间充质干细胞复合胶原蛋白海绵支架对大鼠股骨缺损的修复作用

目的 探究过表达miR-378a修饰骨髓间充质干细胞(BMMSCs)复合胶原蛋白海绵(CS)支架修复大鼠股骨缺损的效果。方法 分离培养BMMSCs并采用流式细胞术鉴定细胞表型。使用过表达miR-378a的慢病毒及阴性空载慢病毒转染BMMSCs,将转染细胞分为3组:过表达miR-378a转染BMMSCs组(LV-miR-378a组)、阴性对照慢病毒转染BMMSCs组(LV-miR-NC组)、未转染BMMSCs组(对照组),并采用流式细胞术检测转染效率。制备转染细胞与CS支架的复合物,使用扫描电镜观察细胞与支架的相容性。建立SD大鼠股骨缺损回植模型,将15只SD大鼠随机分为3组(n=5):LV-miR-378a+CS组(植入过表达miR-378a慢病毒的BMMSCs复合CS支架)、LV-miR-NC+CS组(植入阴性空载慢病毒转染的BMMSCs复合CS支架)、CS组(只植入CS支架)。术后第8周,使用CO_(2)吸入法处死SD大鼠,取手术侧股骨样本进行大体观察、微型CT扫描重建,定量分析骨密度(BMD)及骨体积分数(BV/TV),并采用HE、Masson及骨桥蛋白(OPN)免疫组化染色观察骨修复情况。结果 流式细胞术检测BMMSCs细胞表型显示,细胞表面抗原CD44阳性表达率95.5%,CD29阳性表达率94.7%,而CD45阳性表达率0.8%,CD34阳性表达率0.7%。流式细胞术检测各组转染效率显示,与对照组比较,LV-miR-378a组和LV-miR-NC组转染效率明显增高(P<0.05),而LV-miR-378a组与LV-miR-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察显示,CS支架材料具有良好的三维空洞结构,两组细胞与CS支架共培养7 d后,LV-miR-378a组较LV-miR-NC组细胞在支架材料表面铺展区域更大,细胞呈团簇状生长,伸出的伪足更多。大体观察结果显示,术后8周,LV-miR-378a+CS组骨缺损区修复较为完全,LV-miR-NC+CS组及CS组骨缺损中心均可观察到未完全矿化的新生骨质,且CS组仍可见缺损区大致轮廓。微型CT三维重建及定量分析结果显示,术后8周,LV-miR-378a+CS组骨缺损区修复效果优于其余两组,新骨沉积量较多,BMD及BV/TV值均明显高于其余两组(P<0.05),而LVmiR-NC+CS组及CS组缺损区均未完全修复,且CS组新骨沉积量较少,密度不均一。HE、Masson染色结果显示,术后8周,LV-miR-378a+CS组支架材料完全降解,可见较多成熟骨小梁,新生骨与宿主骨交界区连续性较好,骨小梁彼此连接且形态规则;LV-miR-NC+CS组成熟骨小梁相对较少,新生骨与宿主骨交界区未完全相连;CS组支架材料未完全降解,处于改建重塑中的骨小梁仍较多且形态不规则。免疫组化染色结果显示,术后8周LV-miR-378a+CS组骨桥蛋白表达率明显低于其余两组(P<0.05),且LV-miR-NC+CS组骨桥蛋白表达率低于CS组(P<0.05)。结论 过表达miR-378a修饰BMMSCs复合CS支架可促进新骨形成。