碱裂解法提取重组质粒DNA及PCR验证

目的:筛选获得高质量质粒,为进一步克隆、测序奠定基础。方法:采用常规的碱裂解法从大肠杆菌重组质粒中提取质粒DNA,核酸检测仪测定提取质粒DNA产量和纯度,并用前期DDRT-PCR时采用的引物进行PCR验证性实验,琼脂糖凝胶电泳检测,并对电泳图谱加以分析和鉴定。结果:利用常规的碱裂解法提取重组质粒,通过酚和氯仿的抽提,可以有效地去除蛋白质杂质,用含有RNase抑制剂的无菌水溶解质粒提取效果最好,得到的质粒DNA无RNA污染,纯度比较高,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之间,OD260/OD230比值大于2.0,经PCR反应验证后与预计相符。结论:通过该方法获得的重组质粒纯度和浓度都比较高,且PCR验证与预计相一致,可以满足后续分子生物学实验的要求。

正交设计优化东亚砂藓DDRT-PCR反应体系

利用正交实验设计L25(56)对东亚砂藓(Racomitrium japonicum)DDRT-PCR反应体系的6因素(Mg2+、dNTP、锚定引物、随机引物、模板DNA、Taq酶)在5个水平上进行优化实验。结果筛选出各反应因素的最佳体系(20μL)为:Mg2+2.25mmol/L、dNTP0.4mmol/L、锚定引物1.0μmol/L、随机引物0.7μmol/L、模板DNA1.6μL、Taq酶2.5U。对东亚砂藓DDRT-PCR最佳反应体系进行梯度PCR引物退火温度筛选,得到的最佳退火温度为45.4℃。该优化体系的建立,为进一步进行东亚砂藓抗旱基因的筛选与克隆等一系列分子研究提供了重要参考依据。

几种提取苔藓植物总RNA方法的比较

将3种RNA提取方法加以比较,以期获得提取不同生境毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera P.Beauv)总RNA的最适方法。经比较,改进后的SDS法更适合于毛尖紫萼藓总RNA的提取。此方法简单快捷,所得RNA完整性好,纯度高,试验稳定性好,可用于RT-PCR、基因克隆等进一步分子生物学研究。