miR-145-5p在正常大鼠与2型糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的表达比较

背景糖尿病会导致骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的成骨分化能力降低,miRNA在此过程中发挥重要作用,其中miR-145-5p对细胞成骨成软骨分化有重要的调节作用。然而miR-145-5p对糖尿病源BMMSCs成骨分化的影响尚不清楚。目的比较正常大鼠与2型糖尿病大鼠BMMSCs成骨分化能力,初步探讨在成骨分化中miR-145-5p及其靶基因SEMA3A和Wnt通路关键蛋白β-catenin表达的差异。方法12只GK大鼠采用高糖高脂饲料喂养构建2型糖尿病大鼠模型,12只Wistar大鼠常规饲养作为对照组。无菌条件下分离大鼠股骨,全骨髓培养法培养正常大鼠和2型糖尿病大鼠BMMSCs(分别对应WT-BMMSCs和GK-BMMSCs);CCK-8检测细胞增殖能力;结晶紫染色检测细胞集落形成能力;碱性磷酸酶染色及半定量分析检测碱性磷酸酶活性;茜素红染色检测矿化基质形成;qRT-PCR和Western blot检测成骨相关标志物、miRNA-145-5p、SEMA3A和β-catenin的表达。结果干细胞培养4~9 d时,GKBMMSCs的增殖水平低于WT-BMMSCs,差异有统计学意义(P<0.01);10 d时,其集落形成率显著低于WT-BMMSCs(P<0.01);成骨诱导7 d时,GK-BMMSCs碱性磷酸酶活性(P<0.001)、成骨相关标志物碱性磷酸酶基因(P<0.01)和蛋白(P<0.001)表达、骨钙素基因(P<0.001)和蛋白(P<0.001)表达均显著低于WT-BMMSCs,1型胶原蛋白(P<0.01)基因的表达显著低于WT-BMMSCs,而Runt相关转录因子2(P<0.001)蛋白表达显著高于WT-BMMSCs。在WT-BMMSCs成骨分化中,miR-145-5p表达下调,SEMA3A表达上调,而在GK-BMMSCs成骨分化中,miR-145-5p和SEMA3A表达均上调,β-catenin(P<0.001)在GK-BMMSCs中的表达显著降低。成骨诱导21 d时,WT-BMMSCs矿化基质染色较深。结论2型糖尿病大鼠BMMSCs细胞增殖、集落形成及成骨分化能力降低,推测在正常大鼠BMMSCs成骨分化中miR-145-5p起抑制作用,在2型糖尿病大鼠BMMSCs成骨分化中miR-145-5p起促进作用。

干细胞衰老与抗衰老的研究进展

衰老是一种不可逆转的自然现象,随着年龄的增长而发生。抗衰老医学是指应用先进的科学和医疗技术,早期发现、预防、治疗和逆转与年龄相关的功能障碍和疾病。关于衰老和抗衰老的研究一直是医学和生命科学领域的研究热点。干细胞是组织再生与修复的基础,也是维持机体新陈代谢的关键。目前普遍认为,干细胞衰老与机体衰老之间存在密切联系,机体衰老过程中必然伴随着体内多种干细胞的衰老,同样,干细胞衰老也会加速机体的衰老。近年来众多研究表明,逆转干细胞衰老对于机体抗衰老具有重要作用,这也是有利于延缓人口老龄化的重要研究方向。本文对干细胞衰老的机制、逆转干细胞衰老的手段以及干细胞在机体抗衰老中的应用及其机制做一综述,以期为干细胞在机体抗衰老和衰老相关疾病治疗中的应用研究提供参考。

贴壁组织块反复消化法培养新生大鼠下颌骨成骨细胞及鉴定

目的探讨经济、高效的原代新生大鼠下颌骨成骨细胞培养方法。方法将新生24hSD大鼠处死并取出下颌骨,剪碎,用改良的贴壁组织块反复消化法培养细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测其增殖能力,通过相差显微镜观察,用骨钙素免疫荧光染色、碱性磷酸酶染色和钙结节染色方法对所获得的细胞进行鉴定。结果MTT实验显示接种后1～3d内细胞增殖缓慢,为细胞生长适应期,第7天达到高峰,以后增长速度逐渐减慢。所培养的细胞能形成矿化结节,碱性磷酸酶染色、骨钙素染色和钙结节染色均呈阳性,具有典型的成骨细胞形态特征。结论改良的贴壁组织块反复消化法可获得大量且纯的新生大鼠下颌骨成骨细胞,所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。

改良大鼠下颌骨成骨细胞原代培养与鉴定

目的:探讨高效的原代成年大鼠下颌骨成骨细胞培养方法,为进一步的实验研究奠定基础。方法:将4-6周SD成年大鼠处死并取出下颌骨,剪碎,用改良的酶消组织块培养法培养细胞,通过相差显微镜观察,用碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫荧光染色和钙结节染色等方法对所获得的细胞进行鉴定。结果:所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色、骨钙素染色和钙结节染色均呈阳性。结论:改良的酶消组织块培养法,可获得大量高纯度的下颌骨成骨细胞,所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。

一种新型的兔牙槽骨缺损模型的建立

目的:探讨新西兰白兔下颌骨门齿远中牙槽骨缺损模型建立的方法及其可行性。方法:正常成年新西兰白兔(2.5kg)麻醉后,在其下颌骨门齿远中做10×4×3mm的缺损,术后0d及术后12w对缺损部位进行X线检查、苏木素伊红及甲苯胺蓝组织学染色。结果:X线及组织学染色显示,于新西兰白兔下颌骨门齿远中做10×4×3mm的缺损未伤及门齿及颏神经。术后12w,缺损处未见明显新生骨生成。结论:成功建立新西兰白兔下颌骨门齿远中牙槽骨缺损模型。本研究为探讨重建牙槽骨缺损及评估植骨材料在颌骨的成骨能力等研究提供了重要的中小型动物模型。

不同激活方法对小鼠卵母细胞孤雌激活胚胎发育的影响

目的观察不同激活方法对小鼠卵母细胞激活的影响，以优化核移植的小鼠卵母细胞激活方案。方法昆明种小鼠经腹腔注射7．5～10U孕马血清促性腺激素（PMSG），48h后腹腔注射同样剂量的人绒毛膜促性腺激素（hCG）。注射hCG后14-16h收集卵母细胞，18h后用单个激活剂激活卵母细胞。单个激活剂包括钙离子载体（A23187，5μmol／L，5min）、乙醇（Eth，7％，7min）、氯化锶（SrCl2，10mmol／L，20min）。结果单个激活剂激活小鼠卵母细胞时，卵裂率同其他组（48％～70％）相比，SrCl2组最高（72％）。囊胚发育率（9％～20％）均高于对照组（1％，P〈0．05），且SrCl2组囊胚率（20％）高于A23187组（9％）和乙醇组（12％，P〈0．05）。单个激活剂同蛋白激酶抑制剂6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）联合使用能使卵母细胞获得完全的激活。乙醇＋6-DMAP组（95％和35％）和SrCh-q-6-DMAP组（92％和31％）卵裂率和囊胚形成率明显高于其他各组（49％～53％和3％～17％，P〈0．05），两组间没有差异。A23187＋6-DMAP组的囊胚率（17％）与对照组（3％）有显著性差异（P〈0．05）。本文还比较了6-DMAP在不同浓度（0．2mmol／L和2．5mmol／L）以及不同激活时间（1．5h和3．5h）与单个激活剂（乙醇或SrCl2）组合对小鼠卵母细胞激活的影响。在高浓度（2．5mmol／L）短时间（1．5h）的6-DMAP组合组囊胚率（34％～36％对3～23％，P〈0．05）和卵裂率较高。结论乙醇和SrCl2与6-DMAP组合，均能较好地激活小鼠卵母细胞，组合中乙醇组合优于SrCl2。此外，6-DMAP的浓度和激活时间也是影响激活效率的重要因素。单个化学激活剂不能完全激活小鼠卵母细胞。

血清浓度及培养时间对人牙周膜细胞生物学活性的影响

目的:探讨血清浓度及培养时间对人牙周膜细胞(HPDLCs)生物学活性的影响。方法:用四唑盐比色法(MTT),BCA蛋白浓度、碱性磷酸酶及羟脯氨酸试剂盒,罗氏诊断cobas誖钙浓度测定试剂盒,放射免疫法检测10mL/L及50mL/L2种浓度的新生牛血清对HPDLCs增殖(1、4、7、10、14、21d)、蛋白质合成、碱性磷酸酶活性、胶原合成、钙吸收及骨钙素分泌(4、7d)的影响。采用SPSS13.0软件包中的双因素方差分析及t检验对数据进行分析。结果:含50mL/L新生牛血清培养液在各时间点均显著促进第4代(P4代)HPDLCs增殖、蛋白合成,显著抑制P4代HPDLCs碱性磷酸酶活性、钙吸收及培养7d时骨钙素分泌,但对细胞胶原合成无影响。在P4代HPDLCs培养过程中,研究选用的2种血清浓度与培养时间仅对细胞增殖、碱性磷酸酶活性及骨钙素分泌有交互效应。结论:血清浓度及培养时间能够影响HPDLCs的生物学活性。

Beagle犬脂肪基质干细胞的培养及分化研究

目的:体外培养Beagle犬脂肪基质干细胞(dog adipose-derived stromal cells,dADSCs),定向诱导分化为脂肪、成骨细胞,为口腔组织工程提供种子细胞。方法:取Beagle犬皮下脂肪组织,剪碎,经I型胶原酶消化培养犬脂肪基质干细胞,取第3代细胞鉴定其来源及干细胞标记并向脂肪、成骨细胞诱导分化。结果:该细胞波形丝蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性,CD44表达阳性;成脂诱导后,经油红O染色可见细胞内脂滴的积累;成骨诱导后,ALP、钙结节、骨钙素、I型胶原均阳性表达。结论:Beagle犬脂肪组织中存在着具有能分化为脂肪、成骨细胞的脂肪基质干细胞,此脂肪基质干细胞可作为口腔组织工程种子细胞来源。

Nogo(N-18)在大鼠脑干及小脑分布的免疫组织化学研究

采用免疫组织化学方法(SP法),研究了Nogo(N-18)在大鼠脑干及小脑的分布并探讨其存在的意义。结果表明,Nogo(N-18)在正常大鼠脑干以及小脑的神经核团有广泛的表达,阳性物质很强地表达于神经元的胞核内,神经元胞体、突起内表达较弱。结论:Nogo(N-18)在脑干及小脑的神经核团广泛表达提示其作为一种髓鞘源性神经突生长抑制因子在中枢神经系统中的存在,可能在正常的神经活动中起重要作用。

GDNF和HSV-GDNF对培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧后的Bcl-2表达的影响

目的:观察细胞胶质源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)和单纯疱疹病毒介导的GDNF(GDNF transformed by herpes simplex virus vector,HSV-GDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧-复氧时的作用和Bcl-2表达的影响。方法:观察缺氧2h、4h和缺氧4h后恢复供氧24、72h时,脊髓运动神经元存活数,并用抗Bcl-2抗血清行免疫组织化学染色,对Bcl-2免疫反应阳性神经元作平均光密度分析。结果:经GDNf、HSV-GDNF孵育的脊髓运动神经元缺氧-复氧后Bcl-2表达较对照组明显增强,神经元损伤程度减轻,神经元存活数明显高于对照组,且HSV-GDNF组的效果更好。结论:GDNF、HSV-GDNF对缺氧-复氧的大鼠脊髓运动神经元有保护作用,HSV-GDNF比GDNF更能增强缺氧-复氧后脊髓运动神经元Bcl-2的表达,提高神经元存活数,抑制缺氧后神经元的死亡。

胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞增殖、分化的影响

目的:探讨胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞(dental follicle cells,DFC_s)增殖、分化的影响。方法:取出生7d的SD大鼠上、下颌磨牙牙囊,原代培养牙囊细胞,选取生长状态良好的第4代细胞,在糖生理浓度(5.5mmol/L)和高糖条件下(16.5 mmol/L和49.5 mmol/L)与6μg/mL胰岛素共同孵育,分别于培养1、3、7、9d时采用MTT法和1～7d采用碱性磷酸酶试剂盒检测胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞增殖、分化的影响。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:所培养的细胞波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性。在第l、3天,16.5mmol/L葡萄糖促进第4代大鼠牙囊细胞的增殖,而49.5 mmol/L葡萄糖抑制牙囊细胞的增殖,胰岛素下调16.5 mmol/L葡萄糖下牙囊细胞的增殖,上调49.5 mmol/L葡萄糖下牙囊细胞增殖;在第7、9天,高糖促进牙囊细胞增殖,胰岛素上调高精下牙囊细胞的增殖。在1～7d内,高糖提高第4代大鼠牙囊细胞碱性磷酸酶活性,胰岛素下调高糖下牙囊细胞的碱性磷酸酶活性(P<0.05)。结论:本实验培养的细胞是来源于外胚层间充质的牙囊细胞。实验结果表明,胰岛素能纠正急性高糖对大鼠牙囊细胞增殖和分化的影响。

Nogo(N-18)在大鼠海马及大脑皮质中分布和发育的免疫组织化学研究

目的 观察Nogo(N 18)在成年大鼠、乳鼠和胎鼠海马及大脑皮质中的分布规律 ,探讨其存在的意义。方法 采用抗Nogo(N 18)多克隆抗体免疫组织化学链霉卵白素 过氧化物酶SP(streptavidinperoxidase,SP)法。 结果 成年大鼠海马以及大脑皮质神经元胞核Nogo(N 18)免疫反应呈强阳性 ,胞浆和突起的反应较弱 ,而乳鼠和胎鼠海马及大脑皮质神经元Nogo(N 18)免疫反应阳性产物只存在于突起和胞浆中。 结论 Nogo(N 18)免疫反应阳性神经元广泛分布于成年大鼠、乳鼠和胎鼠海马及大脑皮质 ,其生物学意义有待探讨。

酶消化贴壁组织块反复消化法培养人牙周膜细胞

目的:牙周膜细胞原代培养成功率较低,探讨经济、高效的原代人牙周膜细胞培养方法,提高原代培养成功率及获得大量原代细胞一直是近年来牙周细胞生物学的研究热点之一。方法:无菌刮出因正畸需拔出牙的牙周韧带,剪碎,用改良的酶消化-贴壁组织块-反复消化法培养细胞,MTT法检测其生长曲线,免疫组织化学鉴定波形蛋白与角蛋白,通过相差显微镜观察、骨分化诱导液诱导后用骨钙素免疫荧光染色、碱性磷酸酶染色和钙结节染色方法对所获得的细胞进行鉴定。结果:所培养的细胞表达波形丝蛋白,骨分化诱导后碱性磷酸酶染色、骨钙素染色和钙结节染色均呈阳性。结论:改良的酶消化-贴壁组织块-反复消化法可获得大量的人牙周膜细胞。

葡萄糖对新生大鼠下颌骨成骨细胞增殖的影响

目的:探讨葡萄糖对体外培养的新生大鼠下颌骨成骨细胞(new born ratmandibular osteoblasts,NRMOBs)增殖的影响。方法:取新生6-7d(Sprague Dawley,SD)乳鼠下颌骨,原代培养下颌骨成骨细胞,选取生长状态良好的第4代细胞,在糖生理浓度(5.5mM)和高糖条件下(16.5mM和49.5mM)培养,于1,3,5,7,9d采用MTT(Methylthiazol Tetrazolium,MTT)法检测不同葡萄糖浓度对体外培养的NRMOBs增殖的影响。采用SPSS13.0软件方差分析对数据进行统计。结果:所培养的NRMOBs阳性表达波形丝蛋白、骨钙素,角蛋白表达阴性,分泌碱性磷酸酶,形成钙结节。细胞在高糖培养1d时,16.5m M与49.5m M葡萄糖均下调了细胞的增殖,49.5m M葡萄糖的抑制有显著性差异(P<0.05);3d时,16.5mM与49.5m M葡萄糖均开始促进细胞的增殖,但与5.5m M葡萄糖比没有显著性差异;细胞培养5、7、9d时,16.5mM葡萄糖显著促进了细胞的增殖(P<0.05),49.5m M葡萄糖在9d时也显著促进了细胞的增殖(P<0.05)。结论:葡萄糖浓度影响NRMOBs的增殖。细胞培养早期,高糖抑制NRMOBs的增殖;细胞培养晚期,高糖逐渐促进NRMOBs的增殖。

胰岛素、雌激素和培养时间对新生大鼠下颌骨成骨细胞增殖的影响

目的:探讨胰岛素、雌激素和培养时间对体外培养的新生大鼠下颌骨成骨细胞(newborn rat mandibular osteoblasts,NRMOBs)增殖的影响。方法:取新生6-7天SD乳鼠下颌骨,原代培养下颌骨成骨细胞,选取生长状态良好的第4代细胞,在糖生理浓度(5.5mM)下与6ug/mL胰岛素(Insulin)和/或10^(-9) mol/L雌激素(E2)共同孵育,于1,3,5,7,9d采用MTT(Methylthiazol Tetrazolium,MTT)法检测胰岛素和雌激素对体外培养的NRMOBs增殖的影响。结果:所培养的NRMOBs阳性表达波形丝蛋白、骨钙素,角蛋白表达阴性,分泌碱性磷酸酶,形成钙结节。NRMOBs在5.5mM葡萄糖下培养,1d时,雌激素显著抑制细胞增殖;7d,9d时,胰岛素显著促进细胞增殖,5.5mM+Insulin组细胞增殖显著高于5.5m M+E2组;雌激素与胰岛素联合应用对细胞的增殖无影响。结论:在不同的培养时间,胰岛素或雌激素单独应用均影响NRMOBs增殖,胰岛素与雌激素联合应用能调节胰岛素或雌激素单独应用时对NRMOBs增殖的影响。

肌源性神经营养因子(MDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧时Bcl-2表达的影响

为证明大鼠肌源性神经营养因子对损伤神经的保护作用 ,本文观察了此因子对缺氧时体外培养的大鼠脊髓运动神经元Bcl-2表达的影响。本实验从成鼠和乳鼠骨骼肌中提取肌源性神经营养因子 ,取 10 0μl (0 .1μg/ml)加入培养的胚胎大鼠脊髓运动神经元的培养液中 ,对照组加入等量的 PBS。然后用液体石蜡封闭液面造成神经元缺氧损伤 ,3 d后行 Nissl染色和免疫组化反应 ,观察和计数大鼠脊髓运动神经元存活数以及 Bcl-2免疫反应阳性神经元数 ,并对 Bcl-2阳性神经元作平均光密度分析。结果发现 :经成鼠和乳鼠肌源性神经营养因子孵育的脊髓运动神经元缺氧后的神经元存活数、Bcl-2阳性神经元数以及平均光密度均明显高于对照组 ,但乳鼠肌源性神经营养因子的效果更好。提示 :大鼠肌源性神经营养因子能增强缺氧时脊髓运动神经元 Bcl-2的表达 ,抑制缺氧后运动神经元的死亡 。

肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养大鼠脊髓运动神经元划伤后Bcl-2表达的影响

为检测大鼠肌源神经营养因子对体外培养大鼠脊髓运动神经元划痕损伤后 Bcl-2表达的影响 ,本实验从成鼠和乳鼠骨骼肌中提取出肌源神经营养因子。在胎鼠脊髓运动神经元培养第 7d时将其随机分成对照组和实验组 (成鼠组和乳鼠组 ) ,取 10 0μl肌源神经营养因子 ( 0 .1μg/ ml)加入实验组 ,对照组加入等量的 PBS,同时进行划痕损伤。损伤后第 3d计数各组存活的运动神经元 ,行 Nissl染色和免疫组化反应 ,计数 Bcl-2免疫反应 ( Bcl-2 -IR)阳性神经元数量 ,并在图像分析仪上对 Bcl-2 -IR阳性神经元作光密度分析。结果发现 ,损伤后第 3d,实验组运动神经元存活数 ,Bcl-2 -IR阳性神经元数和平均光密度均明显高于同期对照组 ,而乳鼠肌源神经营养因子组功效优于成鼠肌源神经营养因子组。结果提示 ,大鼠肌源神经营养因子对体外培养的受损运动神经元具有增强 Bcl-2表达、减少凋亡和损伤修复等作用 。

肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧时p53表达的影响

本研究目的是观察缺氧时肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元p53蛋白表达的影响。从成鼠和胎鼠骨骼肌中提取MDNF。在胎鼠脊髓运动神经元培养第7 d时将其分成对照组和实验组(包括成鼠MDNF组和胎鼠MDNF组),取100μl MDNF(0.1μg/ml)加入培养大鼠脊髓运动神经元的培养液中,对照组加入等量的PBS。然后用液体石蜡封闭液面造成神经元缺氧损伤,缺氧3 d后,应用Nissl染色、原位末端标记、免疫组化方法,对损伤的大鼠脊髓运动神经元进行检测。结果表明:培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧3 d后,经MDNF孵育可使脊髓运动神经元TUNEL、p53表达均较对照组明显减弱,神经元损伤程度减轻,神经元存活数明显高于对照组,且胎鼠MDNF的效果更好。提示:大鼠脊髓运动神经元缺氧后可出现神经细胞凋亡,但胎鼠MDNF较成鼠MDNF更能减弱缺氧时脊髓运动神经元p53的表达,抑制缺氧后神经元的死亡。

年龄及术前合并症对口腔癌患者术后并发症的影响

目的探讨老年口腔癌患者年龄及术前合并症等因素对术后并发症的影响。方法回顾性分析2014年1-7月解放军总医院口腔科收治的行手术治疗的106例口腔癌患者(老年口腔癌患者66例,非老年口腔癌患者40例)的资料,分析年龄及术前合并症与患者术后并发症的关系。结果老年口腔癌组术前高血压、心脏病、肺部疾病、贫血及多种合并症与非老年口腔癌组比较明显增高(P<0.05);但两组间术后并发症发生率差异无统计学意义。老年口腔癌组27例存在≥2种合并症的患者中14例(51.9%)术后发生并发症,与老年口腔癌组并发症的总体发生率(17例,25.8%)比较差异有统计学意义(P=0.0244)。非老年口腔癌组中,15例存在合并症的患者中术后有6例(40.0%)发生并发症,与老年口腔癌组并发症的总体发生率比较差异无统计学意义(P=0.4462)。糖尿病、肺部疾病、低蛋白血症和贫血等4种术前合并症均与无并发症的老年口腔癌组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论年龄不是老年口腔癌患者术后并发症的独立因素,糖尿病、肺部疾病、贫血、低蛋白血症等术前合并症是老年口腔癌患者术后发生并发症的高危因素。