水牛早孕诊断方法比较研究

本试验的目的是通过比较几种不同的妊娠诊断方法,建立一套简便而准确的水牛早孕诊断方法。选择体况相似的8头中国沼泽型奶水牛为研究对象,通过视诊法连续观测8头母水牛配种后15个时间点眼睛形态学特征的变化;采用ELISA法检测8头母水牛人工授精后8个时间点晨血的血清中孕酮、雌二醇水平;采用牛早孕试纸检测卡检测尾根血清中的早期妊娠相关糖蛋白,以上早孕检测结果均与B超孕检结果进行对比分析。结果发现:配种后前28d观测水牛的眼部未见异常形态;怀孕母牛的孕酮水平均为5.76ng/mL,自16d开始保持在4.9~8.43ng/mL,至24d有小幅度升高,而未怀孕母牛的孕酮水平则表现下降趋势;配种后28d时采用牛早孕试纸检测卡检测发现有4头水牛怀孕,与B超孕检结果相一致。可以得出,配种后前28d形态学观察法不适用于水牛早期的妊娠诊断;孕牛与未孕母牛的孕酮激素水平变化规律存在差异,可为今后建立水牛早孕诊断方法提供技术支撑;牛早孕试纸检测卡在28d后获得较高的准确率,可应用于水牛早期妊娠诊断。该试验的开展可为今后水牛早期妊娠诊断研究提供参考,同时对促进水牛产业的健康发展具有重要的意义。

基于GEO数据库筛选与水牛肌内脂肪沉积相关的候选基因及生物信息学分析

【目的】筛选与水牛肌内脂肪沉积相关的关键基因,为挖掘改善水牛肌内脂肪沉积的分子标记提供参考。【方法】通过GEO数据库下载GSE19586数据集,使用limma R语言程序包筛选广西水牛和青海牦牛36月龄背最长肌的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),使用clusterProfiler R语言程序包分别对上调、下调的DEGs进行GO功能和KEGG通路富集分析,使用STRING在线软件对DEGs进行蛋白互作(PPI)网络分析,并使用Cytoscape 3.9.1软件对其结果进行可视化,筛选排名前二十的枢纽基因。【结果】本研究共筛选出254个DEGs,其中61个上调,193个下调。GO功能富集结果显示,上调DEGs主要富集于肌动蛋白-肌球蛋白细丝滑动、肌球蛋白复合体、肌球蛋白结合、甘油三酯代谢、酰基甘油代谢、中性脂代谢、细胞凋亡信号通路调控等过程;下调DEGs主要富集于短链脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸代谢、细胞对酮的反应、细胞基质连接、脂蛋白合成及蛋白质的成熟、加工、聚合等过程。KEGG通路富集结果显示,上调DEGs主要参与代谢途径、脂肪细胞因子、胰岛素抵抗、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)、甲状腺激素信号转导途径和碳水化合物消化吸收等信号通路;下调DEGs主要参与代谢途径、吞噬体、溶酶体、黏着斑和细胞凋亡等信号通路。PPI网络中共有116个节点和205条连线,其中上调蛋白26个,下调蛋白90个;筛选出的前20个枢纽基因分别为ACTB、PPARGC 1、NR3C 1、FOS、GOT 2、SERPINE 1、RAC 1、LEP、STAT 5 B、HPRT 1、DDC、FABP 1、HDAC 1、RHOA、EEF 1 A 1、PCK 1、SOD 2、PRKCB、GPX 1和CTGF。【结论】本研究共筛选出广西水牛和青海牦牛36月龄背最长肌DEGs 254个,挖掘到可能与水牛肌内脂肪沉积相关的候选基因MYH 3、GPX 1、LDLR、LEP和PCK 1,为寻找改善水牛肌内脂肪沉积的分子标记提供了理论基础。

水牛ACSL基因家族全基因组及表达分析

为鉴定水牛长链脂酞辅酶A合成酶(long-chain fatty Acyl-CoA synthetases,ACSLs)的家族成员并探究该基因家族在泌乳方面的功能,通过生物信息学技术对水牛ACSL基因家族进行了motif、基因结构分析、共线性分析、不同物种系统进化分析,运用qPCR技术检测ACSLs在不同组织的mRNA表达量。结果表明:水牛ACSL基因家族共有5个家族成员并分别命名为bbu.ACSL1、bbu.ACSL3、bbu.ACSL4、bbu.ACSL5和bbu.ACSL6。染色体分布情况结果显示:bbu.ACSL1位于1号染色体,bbu.ACSL3位于2号染色体,bbu.ACSL4位于25号染色体,bbu.ACSL5位于23号染色体,bbu.ACSL6位于9号染色体。这5个ACSL氨基酸数在699~722 aa,所有蛋白的等电点除ACSL6外均大于7.00。Motif分析发现,除ACSL3和ACSL4缺少motif8外,其余均含有预测出的Motif 1~10,且排序相同。物种内共线性分析结果显示,水牛和普通牛中均不存在串联重复和片段重复,种间共线性分析结果显示,水牛ACSL与普通牛ACSL存在4对片段重复基因。不同物种ACSL系统发育分析显示,ACSL基因家族具有较高的保守性,其中水牛与普通牛和牦牛的聚类更为相近。不同组织表达量分析发现ACSL1、ACSL3在乳腺组织的mRNA表达量高于其他组织,ACSL6在大脑的mRNA表达量高于其他组织,ACSL4在肺部的mRNA表达量高于其他组织,ACSL5在肝的mRNA表达量高于其他组织。根据RNA-seq测序结果分析不同泌乳时期表达量结果显示,ACSL1在整个泌乳期均有高表达量,尤其是在泌乳第50、140和280天。ACSL3和ACSL5在泌乳第7天和第50天高表达,但随着泌乳天数增加,表达量降低。ACSL4和ACSL6在泌乳第7天表达量最高,但在整个泌乳期的表达量均远低于该家族的其他3个成员。

陆川猪热休克蛋白90基因的克隆与序列分析

【目的】对陆川猪热休克蛋白90(HSP90)基因进行克隆与序列分析,为研究HSP90与陆川猪抗热应激的相关性及寻找猪耐热性分子标记奠定基础。【方法】根据Gen Bank已发表的猪HSP90基因序列(登录号NM_213973.1)设计引物,RT-PCR扩增HSP90基因编码区序列,并应用Laser Gene、Meg Align等生物软件进行序列分析及蛋白质结构预测。【结果】克隆获得陆川猪HSP90基因编码区序列长2202 bp,编码733个氨基酸,分子质量84774.8 U,理论等电点4.93;与野猪的亲缘关系最近,其氨基酸同源性为100.0%,与牛、绵羊、人类、大猩猩的氨基酸同源性也在96.2%以上。陆川猪HSP90蛋白N端有1个HATPase_c superfamily保守结构域,C端最末端有一个MEEVD保守序列,氨基酸序列中存在5个HSP90家族特有保守信号区,其成熟肽包含有α螺旋、β转角、延长线和无规卷曲4种二级结构元件。【结论】猪HSP90基因高度保守,可作为研究陆川猪抗热应激的候选基因之一。

摩拉水牛二酰甘油酰基转移酶2基因的多态性检测

本研究旨在检测水牛二酰甘油酰基转移酶2(diacylglycerolacylt-ransferase,DGAT2)基因的单核苷酸多态性(SNP),探究摩拉水牛多态性位点的群体遗传特征。以广西水牛研究所的57头摩拉水牛为材料,PCR扩增DGAT2基因的部分序列(外显子2及内含子2、3),通过常规测序法检测其SNP,并运用遗传多样性分析软件(POPGENE)和SPSS软件对群体的多态性位点进行基因频率、基因型频率、多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)及遗传杂合度(He)的检测。结果表明,在摩拉水牛DGAT2基因外显子2和内含子2、3上共发现了9个SNPs位点(IVS2.54G>A、IVS2.158A>G、EVS2.191A>G、EVS2.228A>G、IVS3.311C>T、IVS3.444A>G、IVS3.451A>C、IVS3.466C>T、IVS3.521C>T),其中EVS2.191A>G位点的突变导致氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸,突变位点间存在一定程度的连锁遗传但接近连锁平衡状态。从基因频率上看,IVS2.158A>G、EVS2.191A>G、IVS3.311C>T、IVS3.451A>C、IVS3.466C>T和IVS3.521C>T 6个SNPs位点的两个等位基因频率有较大差异,提示等位基因频率较大的基因个体可能更适合生存。9个SNPs位点在摩拉水牛品种上多处于高度多态,杂合度在0.1744~0.4975之间,说明摩拉水牛群体中DGAT2基因遗传多态性丰富,具有较大的育种价值和性状改良潜力。

水牛Smad4基因的克隆及其真核表达载体的构建

为了阐明Smad4基因在水牛卵巢颗粒细胞增殖及胚胎发育中的分子机制,试验采用RT-PCR扩增并克隆水牛Smad4基因,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,构建Smad4基因的真核表达载体,通过脂质体转染法转染体外培养的牛卵巢颗粒细胞。结果表明,试验克隆得到水牛Smad4基因编码序列,编码区全长为1 662bp,编码553个氨基酸。通过BLAST对水牛Smad4基因的核苷酸序列进行同源性比对,结果显示,水牛Smad4基因与牛的同源性为99%,与绵羊、猪、马、人的同源性分别为98%、96%、96%和95%。系统进化树分析表明,Smad4基因在不同物种的进化过程中具有高度的保守性。试验成功构建了水牛Smad4基因的真核表达载体pEGFP-N1-Smad4,并在水牛卵巢颗粒细胞中表达出较强的绿色荧光蛋白Smad4-EGFP融合蛋白。本研究成功克隆了水牛Smad4基因,并成功构建了Smad4基因的真核表达载体,为进一步研究Smad4基因在水牛胚胎发育过程中的分子机制奠定基础。

水牛p21基因在卵母细胞体外成熟过程中的表达及其真核表达载体构建

旨在检测p21基因在水牛卵母细胞体外成熟过程中的表达变化,并克隆摩拉水牛p21基因CDs序列,构建真核表达载体。收集体外成熟培养不同时期(0、6、12、24h)和不同形态[有第1极体(first polar body,PB1)PB1和无PB1]的水牛卵母细胞,通过RT-qPCR检测其p21mRNA相对表达量。同时利用RTPCR技术从摩拉水牛卵巢颗粒细胞中扩增出p21基因编码序列,插入pEGFP-N1真核表达载体中,构建出重组质粒。将重组质粒pEGFP-N1-p21转染水牛颗粒细胞,并于培养24h和48h后观察转染细胞的荧光表达情况。收集转染48h后的颗粒细胞,通过RT-qPCR检测p21mRNA相对表达量。结果显示,成熟培养6h的卵母细胞p21mRNA表达量显著高于成熟培养0、12、24h的表达量(P<0.05),有PB1的卵母细胞中p21mRNA的表达量显著高于无PB1的卵母细胞(P<0.05);重组质粒pEGFP-N1-p21转染颗粒细胞后,有绿色荧光蛋白表达,且与转染pEGFP-N1和空白组相比,pEGFP-N1-p21转染组的p21mRNA表达量显著升高。结果表明,在体外成熟培养过程中均能检测到水牛卵母细胞p21mRNA表达量,成功构建了摩拉水牛p21基因真核表达载体,为下一步研究p21基因在水牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中的功能和调控奠定了基础。

摩拉水牛和尼里-拉菲水牛PRKAA2基因SNPs检测及遗传多样性分析

为研究水牛蛋白激酶AMP活化的催化亚基α2(protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2,PRKAA2)基因多态性,本试验以摩拉水牛和尼里-拉菲水牛基因组DNA为模板,扩增PRKAA2基因外显子4及内含子3部分序列,通过常规测序法检测其SNP并进行遗传多样性分析。结果发现,PRKAA2基因外显子4内存在1个SNP位点(c.462G>A),PRKAA2基因内含子3部分序列存在3个SNPs位点(IVS3.557T>C、IVS3.560C>T和IVS3.565G>A)。经遗传多样性分析表明,在c.462G>A位点的野生纯合型和杂合型比突变纯合型更有优势,IVS3.557T>C和IVS3.560C>T位点的突变纯合型为非优势基因型,IVS3.565G>A位点杂合型为优势基因型。IVS3.565G>A位点在摩拉水牛群体中处于Hardy-Weinberg非平衡状态;c.462G>A位点在尼里-拉菲水牛群体中处于Hardy-Weinberg非平衡状态。4个SNPs位点在摩拉水牛群体中均为中度多态;c.462G>A、IVS3.557T>C位点在尼里-拉菲水牛群体中为低度多态,IVS3.560C>T、IVS3.565G>A位点为中度多态。IVS3.557T>C位点在两个水牛群体中杂合度较低。说明摩拉水牛IVS3.565G>A位点和尼里-拉菲水牛c.462G>A位点的基因型频率和基因频率遗传状态不平衡,尼里-拉菲水牛群体中IVS3.557T>C位点遗传变异小,选择潜力不高。4个多态位点可以构建5种单倍型,其中T-C-G-G是摩拉水牛群体和尼里-拉菲水牛群体的优势单倍型。综上,本研究检测的摩拉水牛和尼里-拉菲水牛PRKAA2基因上4个SNPs位点可为水牛标记辅助选择育种提供参考。

阴道分泌物在动物发情鉴定中的研究进展

在家畜及实验动物的繁殖工作中,发情鉴定既是关键也是难点,准确的发情鉴定对于繁殖机制研究和提高繁殖效率都具有重要意义。阴道分泌物是一种较为易于获得的鉴定材料,同时也能更直接地反映动物子宫状况。本文简要介绍了国内外学者通过阴道分泌物鉴定动物发情的研究进展,并对此类研究的应用前景进行探讨。

代谢组学在奶牛上的应用研究进展

奶牛代谢产物的变化可以直接反映其体内各种生命活动的变化,利用代谢组学技术能够清晰并且直观地表征奶牛在不同生理状态下的全局代谢变化。代谢组学自2008年首次应用于奶牛后,其在奶牛的生殖生理研究、营养生理学研究、胴体品质和牛奶质量、预测饲料效率、疾病检测的生物标记开发等方面的文献不断出现。本文通过综述代谢组学在奶牛疾病、营养、繁殖育种和生产管理几个方面的应用,旨在为进一步利用代谢组学开展奶牛的重要经济性状基础研究提供参考。

水牛繁殖性状相关基因研究进展

在畜牧生产中,繁殖性状是一个非常重要的经济性状,繁殖性能的高低与动物生产效益密切相关。水牛是我国南方重要的物种资源,它具有耐粗饲、适应性强和易饲养等特点。而且水牛肉肉质鲜美,易于消化;水牛奶更是营养丰富全面,是制作高档奶制品的优质原料,一直以来,深受广大消费者青睐。然而,尽管我国水牛存栏量多,但水牛繁殖力低,一直是制约水牛产业发展的重要因素。如何提高水牛繁殖性能已成为当下研究的重点。为此,本文主要从分子水平上对近年来水牛繁殖性状相关基因的研究进展做一概述,并展望其应用前景。

黄体对牛胚胎移植效果的影响

黄体释放的黄体酮对母畜发情周期、启动发情行为和维持妊娠起着至关重要的作用,但目前国内外对黄体是否影响胚胎移植效果有着不同报道。本文以探究黄体对牛胚胎移植效果的影响为主线,查阅大量文献,归纳黄体的检查和级别判断方法,分别分析黄体大小、黄体位置、黄体质量和黄体生产溶解过程激素水平与胚胎移植受胎率的关系,为提高胚胎移植效果提供科学的参考依据。生产上常通过B超扫描结合直肠检查法判断受体牛黄体发育和位置作为能否移植的依据;由各学者研究结果可见,不同直径黄体的胚胎移植受胎率差异不显著,为提高受体牛的利用,在对受体牛黄体大小选择时可适当放宽标准;胚胎移植到黄体同侧的受胎率比移植到黄体对侧的高,另外,可能因为操作者左右手操作习惯不同,发现左侧黄体移植受胎率比右侧的要高;较多学者认为质量好的胚胎选择黄体质量好的受体移植才能得到更高的受胎率;胚胎移植后能否成功受孕,还与黄体生成溶解过程中孕酮含量及孕酮与雌二醇的比例等有关。

猪miR-486慢病毒表达载体的构建及鉴定

mi R-486在肌肉生长发育和肌肉疾病的发生中具有重要的功能,本研究旨在构建猪mi R-486慢病毒表达载体,鉴定其在巴马小型猪成纤维细胞中过表达水平,并利用胞质注射生产转基因胚胎,为研究mi R-486在肌肉生长发育中的功能奠定基础。以巴马小型猪基因组DNA为模板,扩增mi R-486前体及部分侧翼序列,利用T4连接酶将其连入p CDH-CMV-MCS-EF1载体,构建LV-mi R-486慢病毒表达载体;在巴马小型猪成纤维细胞中过表达mi R-486并利用Real-time PCR验证其过表达效率,通过胞质注射生产转mi R-486的猪胚胎。双酶切和测序结果证明成功构建了LV-mi R-486重组载体,将慢病毒载体转染巴马小型猪成纤维细胞后mi R-486上调,经胞质注射后在胚胎发育早期和囊胚期均有绿色荧光表达。本研究成功构建了猪mi R-486慢病毒表达载体,在巴马小型猪成纤维细胞中过表达并生产出转mi R-486的阳性胚胎,为后续研究mi R-486的功能奠定基础。

广西巴马小型猪GK基因真核表达载体的构建及鉴定

GK基因在糖尿病的发生中具有重要功能,本研究旨在构建广西巴马小型猪GK基因真核表达载体,为生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定一定基础。以广西巴马小型猪肝脏组织为材料,通过RT-PCR的方法扩增并克隆猪GK基因的编码序列,并进行生物信息学分析,并将GK基因亚克隆至p EGFP-N1载体上,构建含有GK基因的真核表达载体p EGFP-N1-GK,经过PCR和双酶切的验证,通过脂质体转染,将重组质粒p EGFP-N1-GK转染猪的PK15细胞,48 h之后通过荧光显微镜观察细胞荧光蛋白的表达。研究结果表明广西巴马小型猪GK基因编码区序列长1 575 bp长的片段,共编码524个氨基酸,与Pubmed中查询到的猪(FJ436399.1)的GK基因同源最高,序列比对发现,在461 bp和534 bp处都发生了C-T的碱基突变,只有461 bp位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,成功构建p EGFP-N1-GK真核表达载体,并在PK15细胞中成功转录表达。为进一步研究葡萄糖激酶基因(GK)与糖尿病之间的关系,以及生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定基础。

广西巴马小型猪presenilin-1基因克隆及多态性分析

本研究的目的是寻找广西巴马小型猪presenilin-1基因SNP位点,并确定各基因型频率。利用RT-PCR的方法扩增并克隆presenilin-1基因,通过测序和对比确定SNP位点,RFLP方法分析100头近交系和封闭群的广西巴马小型猪的基因组DNA,确定该突变位点的分布情况。结果显示,成功克隆广西巴马小型猪presenilin-1基因CDS区全长并确定T188C错义突变位点,SNP检测确定,在33头近交系中TT型占93.9%,TC型占6.1%;在67头封闭群中TT型占64.2%,TC型占35.8%,在封闭群和近交系中均未发现CC基因型。本研究成功验证了presenilin-1基因的SNP位点,为下一步研究presenilin-1基因T188C突变位点的功能奠定基础。

褪黑素受体1A基因多态性与水牛繁殖性能的关联分析

为了探讨褪黑素受体1A(MTNR1A)基因多态性对水牛繁殖性能的影响,试验以86头摩拉水牛经产牛为研究对象,采用PCR方法扩增其MTNR1A基因外显子Ⅱ序列,测序后分析该序列的多态性位点;记录86头摩拉水牛经产牛在2019年1月份—2020年12月份期间的怀孕和产犊情况,分析MTNR1A基因外显子Ⅱ的多态性与繁殖性能间的关系。结果表明:成功克隆到MTNR1A基因外显子Ⅱ,测序发现其第72位碱基处存在C>T单核苷酸多态性(SNP)位点,该位点有3种基因型,即CC、CT和TT基因型;C和T等位基因频率分别为0.47和0.53,CC、CT、TT基因型频率分别为0.37,0.30,0.33。CC和CT基因型摩拉水牛在2019年1月份和8—12月份时的怀孕数量均高于2019年2—7月份,TT基因型水牛在2019年2—7月份时的怀孕数量高于2019年1月份和8—12月份。摩拉水牛产犊季节主要集中在2020年1月份及9—12月份,经计算产犊数量占总产犊数的56.98%;2020年2—8月份是摩拉水牛产犊的淡季,经计算产犊数量仅占全年产犊总数的43.02%。CC和CT基因型的摩拉水牛产犊时间主要集中在2020年1月份和8—12月份,TT基因型水牛的产犊时间则变化不大。说明MTNR1A基因外显子Ⅱ第72位碱基处存在C>T SNP位点,可以作为一种基因标记,加速水牛良种选育进程。

姜黄素对水牛卵巢颗粒细胞体外培养的影响

本试验研究了添加姜黄素对水牛卵巢颗粒细胞体外培养过程中增殖、凋亡自噬及间隙连接等生物学过程的影响。设置不同浓度（1,5,10,25,50,100μg/m L）的姜黄素,对颗粒细胞的凋亡、增殖、自噬和间隙连接等基因与蛋白的表达进行定性与定量检测,发现高浓度姜黄素会导致细胞凋亡标记Caspase-3及自噬基因Beclin-1的基因表达量上升,间隙连接蛋白Cx43基因表达量下降,细胞增殖标记PCNA表达量无显著变化。研究结果为姜黄素在调节卵巢颗粒细胞功能提供了一定的理论依据。

RAPD标记鉴别四个水牛品种的初步研究

为进一步保护和开发中国本地水牛和国外引进水牛的遗传资源,建立快速区分鉴别本地和引进水牛品种的方法。设计57条随机扩增多态性(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)引物,对本地沼泽型水牛和国外引进的河流型(摩拉,尼里拉菲和地中海)水牛之间的遗传差异进行了调查。以128头水牛DNA样本为模板,通过PCR扩增从57条RAPD引物中筛选并优化反应条件。实验结果显示,筛选得到了5条可用于区分本地沼泽型水牛与引进河流型水牛的引物(OPG6,OPG7,S11,S40和S1013),建立了RAPD鉴别区分沼泽与河流水牛的方法。本实验的结果为中国水牛的杂交改良、良种培育和本地水牛种质资源的保护等工作提供了理论和实验依据。

水牛CART基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测

为探讨水牛可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)基因功能,以水牛卵巢组织RNA转录的cDNA为模板,参考GenBank预测的水牛CART基因组序列设计引物,采用PCR和在线生信分析软件对CART基因进行克隆和蛋白质结构预测分析。结果显示:水牛CART基因CDS区全序列长为351 bp,编码116个氨基酸;对所得核酸序列和蛋白质结构分析预测显示,水牛CART基因与美洲野牛、野牦牛、普通牛、羊、双峰驼、单峰驼、野猪、马、非洲野驴、人类及猕猴相似程度分别为100%、98%、100%、98%、91%、91%、78%、85%、85%、81%、90%;Mega分析显示在多胃反刍动物间有较高同源性;蛋白质结构预测显示,CART蛋白含有N端信号肽,是分泌蛋白,功能与神经、辅酶和离子结合相关。