甜瓜CmERFIV-5基因cDNA的克隆·表达分析及载体构建

[目的]研究甜瓜Cm ERFIV-5基因的克隆、表达分析及超表达和RNAi载体构建。[方法]根据Gen Bank上登录的甜瓜一个乙烯应答因子(ethylene responsive facter,ERF)基因c DNA序列(登录号:MELO3C024315)设计合成特异性引物。应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumismelo L.cv.Hetao)成熟果实中克隆得到该基因c DNA序列,命名为Cm ERFIV-5,分析了该基因在甜瓜根、茎、叶及果实发育过程中的表达特性,将其构建到过量表达载体p PZP221中,得到重组植物表达载体p PZP221-Cm ERFIV-5。同时,构建了该基因RNAi载体p ART-27-Cm ERFIV-5。[结果]序列分析显示,所克隆的c DNA长度为808bp,编码255个氨基酸。荧光实时定量PCR分析表明,Cm ERFIV-5基因在甜瓜根、茎、叶及不同发育时期的果实中均有表达,在叶片中表达量最高。[结论]构建了Cm ERFIV-5基因的过量表达载体与RNAi载体,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

甜瓜CmDWF1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是调节植物生理活动的重要植物激素,DWF1是油菜素内酯合成途径中重要的合成酶之一。为了研究油菜素内酯合成酶基因DWF1在甜瓜果实发育过程中的功能,从甜瓜中克隆得到CmDWF1基因,并对该基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR方法分析了该基因在甜瓜不同组织器官中的表达。结果表明:CmDWF1基因的开放阅读框片段长为1 701 bp,编码566个氨基酸,预测其编码蛋白的分子质量为66.115 11 ku,理论等电点为6.96,不稳定指数为48.18,总平均亲水性为-0.402,属于亲水性蛋白。CmDWF1蛋白含有FAD-binding-4结构域,推测其具有FAD氧化还原酶特性。该蛋白信号肽序列,在细胞质中的定位系数为9,推测其主要在细胞质中分布。二级结构预测显示,CmDWF1蛋白中α-螺旋的含量相对较高,为37.81%。系统进化分析表明,CmDWF1蛋白与黄瓜的亲缘关系较近;实时定量PCR结果表明,该基因在甜瓜的根、茎及叶中均有表达,但在根中表达量最高,并且在甜瓜果实授粉后25 d内表达量有明显的上升,35~45 d内表达量呈下降趋势。由以上结果可知,CmDWF1基因可能参与甜瓜油菜素内酯的合成,并进一步调节甜瓜的生长发育。