小龙虾prx6基因在对抗金黄色葡萄球菌感染中的分子作用机制研究

【目的】旨在研究prx 6基因在小龙虾先天免疫中的调控作用机制,探索小龙虾prx 6基因在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染后发挥免疫调控作用的可能分子机制。【方法】选取prx 6基因作为研究对象,提取正常小龙虾各组织的总RNA,利用RT-qPCR分析目的基因在小龙虾各组织中的分布,并检测S.aureus免疫刺激后,prx 6基因在小龙虾相关组织中的表达模式。通过RNA干扰技术(RNAi)敲低prx 6基因表达量,在感染S.aureus后,测定小龙虾肝胰腺中Pc-crustin 3、Pc-crustin 4、Pc-ALF 9和Pc-lectin 1免疫效应基因的相对表达量。同时,进一步对小龙虾血淋巴中的细菌载量进行统计分析。【结果】通过对prx 6基因在小龙虾各组织的表达水平分析,观察到该基因在肝胰腺的表达量显著高于其他组织。在S.aureus感染后,小龙虾肝胰腺、血细胞和肠组织中prx 6基因的表达量显著上调,在鳃组织仅有早期表达量有所增加。小龙虾存活率的检测结果表明RNAi下调prx 6基因表达量之后,其生存率显著低于dsGFP+S.aureus对照组。为了进一步探索死亡率升高的原因,研究了抗菌肽基因在抗细菌防御中的表达水平。RNAi实验结果显示,在prx 6基因表达量降低的情况下,小龙虾肝胰腺Pc-crustin 3、Pc-crustin 4、Pc-ALF 9以及Pc-lectin 1基因表达水平都出现了显著下降。此外,小龙虾血淋巴中的细菌载量检测结果显示,prx 6基因RNAi组的细菌载量显著高于dsGFP+S.aureus对照组。【结论】小龙虾prx 6基因通过影响抗菌肽基因的表达,以及血淋巴细菌清除能力来参与抗细菌先天免疫应答。

克氏原螯虾duox1基因抵御金黄色葡萄球菌侵染的先天免疫机制

【目的】探究双氧化酶1基因(duox1)在克氏原螯虾抵抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)侵染先天免疫应答中的作用机制,为确保克氏原螯虾产业的持续健康发展提供技术支撑。【方法】采用实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌刺激后,duox1基因在克氏原螯虾血细胞、肝胰腺、肠道及鳃组织中的表达情况;通过RNA干扰(RNAi)敲低duox1基因表达再进行金黄色葡萄球菌刺激,统计克氏原螯虾存活率,采用H_(2)O_(2)含量检测试剂盒检测肝胰腺H_(2)O_(2)含量,电子显微镜下观察血淋巴黑化现象,并以实时荧光定量PCR检测肝胰腺中抗菌肽基因(toll1、dorsal、crustin3和crustin4)的表达情况。【结果】经金黄色葡萄球菌刺激后,克氏原螯虾duox1基因在血细胞、肝胰腺、肠道及鳃组织中的相对表达量较PBS组整体上呈上升趋势,故推测duox1基因参与克氏原螯虾的抗菌先天免疫应答,具有潜在的抵抗细菌侵染作用。与dsGFP+金黄色葡萄球菌组相比,经RNA干扰及金黄色葡萄球菌刺激后,克氏原螯虾存活率呈明显下降趋势,肝胰腺H_(2)O_(2)含量呈先降低后回升的变化趋势(在刺激后24 h达最低值),且克氏原螯虾血淋巴黑化反应程度明显减弱。干扰duox1基因表达并感染金黄色葡萄球菌后,克氏原螯虾肝胰腺Toll信号通路上的抗菌肽基因(toll1、dorsal、crustin3和crustin4)表达被抑制,导致参与抗菌反应的先天免疫能力下降,最终引起克氏原螯虾存活率下降。【结论】克氏原螯虾duox1基因通过调控H_(2)O_(2)产生、影响血淋巴黑化现象及调控toll1、dorsal、crustin3和crustin4等抗菌肽基因的表达,参与机体的先天免疫应答,进而协助机体抵御金黄色葡萄球菌的侵染。