大鼠Notch1胞质段的克隆及其表达

Notch 1信号途径参与决定细胞命运 ,其水解后产生的活性片段———胞质段 (Notch 1intracellularcytoplasmicdomain ,NICD)能被转运进核 ,激活下游靶基因的表达 .Notch 1参与细胞的增殖、分化、程序性死亡、发育过程中的形态发生和器官形成等许多重要过程 .为了获得重组的NICD ,以大鼠脑cDNA文库为模板 ,用PCR方法扩增出编码NICD的基因片段 ,克隆至谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX KG中 ,并在大肠杆菌中获得较高水平的表达 .表达的融合蛋白GST NICD分子质量约为 12 0ku左右 ,以包涵体和可溶性两种形式存在 ,易于亲合层析纯化 .为制备抗体和进一步的功能研究奠定了基础 .

川芎素对脑缺血再灌注损伤细胞外信号调节激酶活化的影响

目的 :观察大鼠局灶性脑缺血 /再灌注后信号转导介质细胞外信号调节激酶 (ERKs)的活化情况以及川芎素对其影响。方法 :雄性成年SD大鼠 4 5只 ,随机分成 3组 :假手术组、对照组和川芎素组 (每组 15只 ) ,分别于缺血时腹腔注射生理盐水 4ml,生理盐水 4ml和川芎素 10 0mg/kg(川芎素用 4ml生理盐水溶解 )。采用线栓法致大脑中动脉阻塞 (MCAO)模型 ,在脑缺血再灌注后的 2h、6h、12h、2 4h和 72h分别处死大鼠 (各组每个时间点 3只 ) ,将脑组织进行免疫组织化学和病理组织学染色观察。结果 :病理组织学显示 ,缺血再灌注 2h ,川芎素组缺血侧皮层神经细胞缺血性损伤较对照组减轻。脑缺血诱导ERKs活化 ,第 6h达高峰 ,并持续到 72h。川芎素组ERKs活化明显较对照组增强 ,而且各时间点ERKs免疫反应阳性细胞数川芎素组显著较对照组增多 (P <0 0 1)。结论 :局灶性脑缺血再灌注可诱导缺血脑细胞部分ERKs活化 ,川芎素干预可使缺血大脑皮质ERKs活化增强 ,减轻皮层细胞的缺血性损伤。

阿魏酸钠对局灶性脑缺血突触后致密物质-95活化的影响

目的 :观察阿魏酸钠 (SF)对局灶性脑缺血损伤的保护作用及其对突触后致密物质 95 (PSD 95 )活化的影响。方法 :雄性 SD大鼠 4 6只 ,随机分成对照组和 SF组 (每组各 2 3只 ) ,分别于缺血时腹腔注射生理盐水 4 m l和 SF1 0 0 m g/ kg(用生理盐水 4 m l溶解 )。采用线栓法制备大脑中动脉阻闭 (MCAO)模型 ,1 6只大鼠(每组各 8只 )在脑缺血再灌注后 2 4 h神经行为学评分完成后被处死 ,取大脑行氯化三苯四唑 (TTC)染色以测量脑梗死容积 ;其他大鼠在脑缺血再灌注后的 30 m in、2 h、6 h、2 4 h和 72 h(各组每个时间点 3只 )分别被处死 ,取缺血侧和对侧皮质以及缺血侧纹状体行 Western blot分析。结果 :术后动物均存活。再灌注 2 4 h神经功能缺损评分对照组明显高于 SF组 ,SF组动物梗死容积〔(6 1 .5± 2 8.7) mm3〕明显小于对照组〔(1 6 8.1±4 2 .2 ) m m3,P<0 .0 1〕。 Western blot分析法表明 ,对照组再灌注 30 m in后 PSD 95在缺血皮质和纹状体活化显著增多并出现高峰 ,持续 72 h;在 SF治疗组 ,再灌注后 30 min PSD 95活化开始增多 ,高峰出现在 2 h,6 h后开始下降 ,而且 PSD 95活化在各时间点较对照组少 ,持续时间短。在对侧皮质未发现 PSD 95的活化。结论 :SF对局灶性脑缺血损伤有神经保护作用 。

逆转录病毒介导的人CNTF在嗅神经鞘细胞中的表达及其对神经细胞存活和突起生长的影响

目的 研究含有睫状神经营养因子 (CNTF)表达调控系统修饰的嗅神经鞘细胞 (OECs)对神经细胞存活和突起生长的影响。 方法 通过基因克隆 ,用KpnⅠ +XbaⅠ将pcDNA3 S(NGF信号肽 ) hCNTF质粒中含有NGF信号肽的CNTF切下 ,插入逆转录病毒表达载体pRev TRE中。酶切鉴定后 ,将其与本系统的调控质粒pRev Tet On转入Ecopack 2 93细胞进行病毒包装 ,制备重组缺陷型hCNTF和Tet On逆转录病毒感染原代培养的大鼠OECs,用不同浓度的强力霉素诱导 ,以Western blot法对hCNTF的表达培养上清进行检测。将转染hCNTF的OECs与新生 2d大鼠DRG联合培养 ,用其上清培养视网膜节细胞 (RGCs)。经 β tubulin免疫组织化学染色后 ,分别测量DRG神经突起的长度并统计阳性RGCs数目。 结果 1 经HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定 ,pRev TRE S hCNTF重组体分别被切下 6 30bp和 4 0 0bp片段 ,插入子的方向和完整性经确认与预期相符。 2 以不同浓度强力霉素诱导hCNTF修饰的OECs ,其培养上清均有分子量约 2 4kD的hCNTF蛋白质的显著特异表达 ,此表达与强力霉素的浓度呈正相关。未诱导组和对照组未见明显蛋白带。 3 同单纯OECs(2 3 15± 4 7)、空载 (2 4 5 5± 5 8)、空白 (16 8± 6 5 )等对照组相比 ,经hCNTF转染的OECs上清组的存活RGC数显著?

小鼠牙本质涎磷蛋白启动子报告基因载体的构建和启动子活性分析

目的 :克隆小鼠牙本质涎磷蛋白 ( dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因启动子 ,构建含DSPP启动子不同片段的报告基因载体 ,在小鼠成牙本质细胞系 MDPC-2 3中分析各种载体中 DSPP启动子活性。方法 :细胞基因组提取 ,PCR、瞬时转染和报告基因检测。结果 :从 MDPC-2 3细胞基因组中克隆出长为1 .5 kbp的 DSPP启动子 ,将启动子酶切成不同的片断 ,克隆到虫荧光素酶报告基因载体 p GL3 -Enhancer,构建出 4种含 DSPP启动子不同片段的报告基因载体 ,将这些报告基因载体瞬时转染至 MDPC-2 3细胞 ,载体中的启动子具有不同的活性。结论 :成功构建了含小鼠 DSPP启动子片段的报告基因载体 ,为以后研究 DSPP基因表达调控的分子机制提供了实验工具。

人Nanog基因的克隆及其在COS-7L细胞中的表达

目的 :克隆人Nanog基因 ,构建其真核表达载体 ,并观察其在哺乳动物细胞COS 7L中的表达。方法 :利用HE2 93细胞的人基因组DNA为模板 ,以LA PCR技术 ,扩增Nango的基因 ,定向克隆到带Flag标签的pCMV载体中 ,测序后 ,挑选序列正确的真核表达质粒pFlag Nanog转染COS 7L细胞。用抗Flag标签的抗体 ,进行Westernblot和间接免疫荧光染色法检测Nango蛋白的表达。结果 :从人基因组DNA中克隆到序列正确的Nanog全长编码序列。所构建的Nanog质粒在COS 7L细胞中获得高效表达。结论 :人Nanog基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS 7L中的表达均获得成功 ,为进一步研究其功能 ,尤其是探讨其在神经干细胞中的作用奠定了基础。

川芎素对大鼠脑缺血再灌注时突触后致密物质-95活性的影响(英文)

应用神经行为学评估、脑梗死容积测量和 Westernblot分析 ,探讨研究阿魏酸钠 (SF)的神经保护作用及其对局灶性脑缺血损伤时突轴后致密物质 - 95 (PSD- 95 )活性的影响 ,证实 SF明显改善再灌注 2 4 h神经功能缺陷和减少脑梗死容积 ,显著增强再灌注后 PSD- 95表达 ,表明 SF可能通过加强PSD-

RT-PCR分析肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素mRNA的表达

目的 观察血管内皮生长因子 (vascular endothelialgrowth factor,VEGF)及 β3整合素 m RNA在肉芽组织血管生成中表达的动态变化 .方法 采用 RT- PCR法定量分析人正常皮下组织、增殖期肉芽组织 (伤后 7～ 12 d)及成熟期肉芽组织 (伤后 30～ 35 d) VEGF及β3整合素 m RNA的水平 .结果 在正常皮下组织中 ,VEGF及β3整合素 m RNA呈低表达 ,而在增殖期肉芽组织中表达升高 ,待肉芽组织完全成熟后二者的表达又有所降低 .结论 VEGF及β3整合素 m RNA的水平与肉芽组织的血管生长过程呈动态相关 。

体外培养海马神经元生长过程中Nogo-A分布的变化

目的 探讨Nogo A在神经元中的表达与神经元发育分化的关系 ,以推测Nogo A在中枢神经系统发育分化过程中的意义。 方法 采用怀孕 18d大鼠胚胎海马神经元体外高密度和低密度培养方法 ,应用免疫荧光细胞化学染色和Westernblot,观察Nogo A在体外培养的大鼠海马神经元的分布模式及其在不同生长阶段的变化。结果 Nogo A在海马神经元生长过程中均表达 ,主要分布在胞浆、胞膜和突起上。神经元突起形成过程中 ,Nogo A主要表达于突起的近端 ,在轴突上随着轴突的伸长逐渐表达于轴突远端和生长锥。Nogo A在成熟神经元网状的突起上呈串珠样分布。 结论 Nogo A在中枢神经系统中具有不同于抑制作用的其他功能 ,可能参与神经元突起生长、轴突投射等过程。

GAP-43原核表达载体的构建、表达及抗GAP-43单克隆抗体的制备

目的 :原核表达神经生长相关蛋白 4 3(GAP 4 3) ,并制备抗GAP 4 3的单克隆抗体 (mAb)。方法 :从含有GAP 4 3cDNA的质粒中 ,用PCR扩增GAP 4 3cDNA的全长编码序列 ,克隆入表达载体pGEX 4T 1中 ,构建GAP 4 3的高表达工程菌 ,并以IPTG诱导表达目的蛋白。通过亲和层析法纯化表达的GST GAP 4 3融合蛋白 ,并以此为抗原制备mAb。结果 :酶切鉴定证明 ,获得含有目的基因片段的重组质粒。表达的GST GAP 4 3融合蛋白以可溶性的形式存在。ELISA检测表明 ,获得的抗GAP 4 3mAb效价为 1∶10 8,其IgG的亚类为IgG2a,亚型为κ型。用Westernblot检测大鼠脑匀浆蛋白 ,在相对分子质量(Mr)为 5 0 0 0 0处有一条特异性带。用此mAb进行荧光免疫法检测表明 ,在致敏豚鼠的肺切片中 ,有GAP 4 3阳性的神经纤维。结论 :所获抗GAP 4 3mAb的特异性强、效价高 ,对进一步研究GAP 4 3在神经系统中的作用提供了有用的试剂。

新型神经营养因子TAT—BDNF生物合成及生物活性研究

目的:合成新型神经营养因子TAT-BDNF并验证其生物活性,为进一步应用功能蛋白质治疗中枢神经损伤提供研究方法。方法:采用分子克隆方法构建带有TAT蛋白转导区序列及无信号肽序列人BDNF基因的原核表达载体pTAT-HA-BDNF。经原核表达系统表达、纯化、复性获得纯净TAT-BDNF融合蛋白。利用体外培养的新生大鼠小脑颗粒细胞,通过双重免疫荧光细胞染色检测其蛋白转导活性;Hoechst33342染色观察TAT-BDNF对颗粒细胞谷氨酸兴奋性毒性损伤神经保护作用。结果:重组质粒能有效的通过原核表达系统表达并获得高纯度TAT-BDNF。免疫荧光细胞染色显示TAT-BDNF能快速转导入小脑颗粒细胞中,并能显著减少由谷氨酸诱导的细胞凋亡坏死的比例,改善神经元的存活状态。结论:合成的新型神经营养因子TAT-BDNF具有蛋白转导活性及神经保护作用。

LINGO-1-Fc蛋白对低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

髓鞘抑制因子Nogo-A、MAG和OMgp通过共同的受体信号复合物NgR/p75NTR(或者TROY)发挥对中枢神经纤维再生的抑制作用.新近克隆的跨膜蛋白LINGO-1是该信号途径的另一个重要组成成分和调节分子.LINGO-1特异表达于中枢神经系统,神经元上的LINGO-1被证明参与调节中枢神经再生的抑制信号,而少突胶质细胞表达的LINGO-1分子参与负调节少突胶质细胞的髓鞘化过程.为探讨LINGO-1分子在神经元凋亡过程中的作用,利用包含LINGO-1分子胞外段LRR和IgC2结构域的Fc融合蛋白作为功能性拮抗剂,研究LINGO-1对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用.利用成熟的Hoechst标记凋亡细胞的方法,观察到经LINGO-1-Fc蛋白预处理2h能够显著阻止小脑颗粒神经元的凋亡.仅包括LRR结构域的GST-LINGO-1与LINGO-1-Fc蛋白,虽同样具有与颗粒神经元的结合活性,但是GST-LINGO-1不能有效地阻止低钾诱导的细胞凋亡.这些结果提示,LINGO-1-Fc蛋白能够阻止低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡,并且这种作用可能是IgC2结构域依赖的.

低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察

目的 :建立大鼠海马神经元低密度体外培养方法 ,并观察其发育分化过程中的形态学指征变化情况 .方法 :采用神经元与星形胶质细胞立体共培养方法 .首先以新生大鼠为实验材料培养纯化单层星形胶质细胞 ,随后以孕 18d胎鼠为实验材料 ,分离海马皮层 ,经胰酶消化制备单细胞悬液 .以(2～ 5 )× 10 3·cm-2 密度接种于包被有多聚赖氨酸的盖玻片上 ,而后采用无血清培养液与星形胶质细胞立体共培养 ,并对不同培养时间的神经元进行形态学观察 .结果 :利用低密度体外培养方法成功培养出海马神经元 ,其在不同发育分化阶段具有不同的形态学特征 .结论 :低密度培养的海马神经元不同发育分化阶段具有不同的形态学特征 。

逆转录病毒介导的人NT-3在嗅神经鞘细胞中的表达及活性检测

本文构建了pRev-TRF-NT-3的逆转录病毒表达载体,通过Fcopack293细胞将其与pRev-Tet-On分别进行包装,制备了重组缺陷型的hNT-3和Tet-on逆转录病毒,用这两种病毒感染原代培养大鼠嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),并经强力霉素(Dox)诱导,获得Dox浓度依赖性hNT-3表达的OECs,最后经过Western-Blot检测hNT-3的表达以及通过DRG与NT-3转染后OECs联合培养来对表达的hNT-3活性进行鉴定,结果:(1)hNT-3-pcDNA的多克隆位点,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,PCR扩增,再用Sall和Hind Ⅲ切下全长编码的hNT-3 cDNA,定向连接到pRev-TRF上,pRev-TRF全长为6.5kb,NT-3全长为0.78kb,pRev-TRE-NT-3重组体经过鉴定,确认插入子的方向和完整性,结果与预期相符。(2)hNT-3修饰的OECs培养上清经Western-blot检测,与hNT-3抗体结合的蛋白条带分子量约为28kd,hNT-3修饰过的OECs上清表达量明显高于未转染组OECs的表达量,且hNT-3表达量与Dox浓度有依赖性。(3)与hNT-3修饰的OECs联合培养背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),有许多DRG细胞向外迁移,这些细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。而未修饰的OECs组,只有少量的细胞迁移生长,细胞迁移和突起生长都很局限,空白对照组的DRG没有向外迁移的细胞和向外延伸的突起;且对照组的突起生长长度明显比NT-3修饰的实验组短(P<0.01)。这些结果表明,Tet-On调控NT-3表达在OECs转染成功,为进一步体内移植修复损伤提供了理想的材料。

中枢神经系统损伤过程中Nogo-A降解片段的检测

目的 观察大鼠脊髓横断、脑缺血和海人藻酸 (KA)注射所致的脑损伤模型Nogo A的降解情况 ,以推测Nogo A降解片段产生的机制和可能的作用。 方法 制作大鼠脊髓横断、脑缺血和KA注射所致的脑损伤模型 ,Western免疫印迹方法检测Nogo A降解片段。 结果 大鼠脊髓横断和脑缺血模型均检测到Nogo A降解片段 ,而KA注射所致的脑损伤模型未发现Nogo A降解片段。 结论 CNS机械性和缺血性损伤可能通过某些机制导致Nogo A发生降解。

氧化应激后大鼠神经元内Nogo-A的表达变化

目的 :探讨大鼠大脑皮层神经元受到氧化应激后Nogo A表达的变化及其可能的作用 .方法 :体外原代培养大鼠大脑皮层神经元 ,给予不同浓度H2 O2 处理 8h后 ,倒置相差显微镜下观察神经元的形态学变化、Hoechst33342和PI染色观察凋亡和坏死情况 ,然后Westernblot观察Nogo A的表达变化 .结果 :大鼠皮层神经元受到 10和 10 0 μmol/LH2 O2刺激后 ,神经元出现胞体回缩、变圆甚至崩解 ,突起断裂、脱落等细胞受损的现象 ;Hoechst33342和PI染色观察到 1μmol/LH2 O2 时神经元凋亡和坏死比例与对照组相比没有差别 ,而 10和 10 0 μmol/LH2 O2 刺激后 ,神经元凋亡和坏死比例明显增加 (P <0 .0 5 ) .Westernblot结果显示 ,1μmol/LH2 O2 时No go A的表达量与对照组相比无明显差异 ,而在 10和 10 0μmol/L时Nogo A的表达量明显升高 (P <0 .0 5 ) .结论 :氧化应激可以上调神经元Nogo A的表达 .

重组肌腱蛋白-R不同功能片段的表达、纯化和生物学功能

:目的 将肌腱蛋白 - R不同功能片段在原核中表达、纯化 ,并研究其初步的生物学功能 .方法 将编码肌腱蛋白 - R不同功能片段的表达质粒 p GEX- EGFL ,p GEX- EGFS,p GEX- FN1- 2 ,p GEX- FN6 - 8,p GEX- FG及空载 p GEX- KG转化入 E.Coli JM10 9中 .用 IPTG诱导表达 ,以谷胱甘肽琼脂糖为填充料进行亲合层析 ,纯化所表达的融合蛋白 .以纯化的融合蛋白作为培养液成分 ,GST为对照 ,观察纯化的肌腱蛋白 - R各功能片段对体外培养脊髓细胞活性及突起生长的影响 .结果 肌腱蛋白 R的 5个片段在大肠杆菌中都有表达 ,通过谷胱甘肽琼脂糖亲合层析 ,都得到了初步纯化 .通过对培养细胞进行 MTT染色 ,NSE染色后图像分析 ,结果表明 ,EGFL ,FN1- 2促进神经元的存活 ,EGFL ,EGFS和 FN6 - 8对突起的生长有明显的促进作用 .结论 肌腱蛋白 - R的不同功能片段可以通过大肠杆菌表达 ,经纯化获得蛋白 ,肌腱蛋白

TAT-NEP1-40融合蛋白的表达、纯化及蛋白转导功能的鉴定

为大量获得高纯度具有蛋白转导功能并可以穿过血脑屏障的融合蛋白TAT-NEP1-40,将构建好的表达载体pTAT-NEP1-40转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达后。将融合蛋白进行纯化和复性,鉴定蛋白转导功能。带有重组质粒pTAT-NEP40的大肠杆菌经IPTG诱导后,主要以包涵体形式表达,融合蛋白的分子量大小为14kD,其表达量占菌体总蛋白量的31.59%,纯化后目的蛋白纯度达95.6%,通过免疫组化染色显示融合蛋白可以穿过血脑屏障进入脑组织。上述结果表明利用pTAT-NEP1-40重组质粒,可以成功地表达TAT-NEP1-40;纯化后该蛋白具有穿过血脑屏障的功能,为NEP1-40功能的进一步研究提供了基础。

MicroRNA-101通过靶向SOX9抑制人胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭

多形性胶质母细胞瘤(GBM)起源于大脑皮质,是最常见的原发性恶性肿瘤.尽管当今的治疗手段不断进步,包括手术、放疗、化疗和光动力治疗等,然而GBM患者的预后情况仍然较差.最近的研究表明,microRNA-101(miR-101)在人肿瘤中显著下调,并与肿瘤细胞的增殖和肿瘤干细胞的自我更新有关.另外,miR-101在神经胶质瘤标本和细胞系中显著下调,但胶质瘤中miR-101的这种下调现象的分子机制尚不明确.本研究发现miR-101可以通过靶向SOX9在体内和体外抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭.沉默SOX9对胶质瘤细胞的增殖和侵袭影响与miR-101类似.qRT-PCR和Western blot检测发现在人神经胶质瘤细胞系U251MG和U87MG中miR-101与SOX9呈负相关,荧光素酶报告分析发现miR-101可以通过靶向SOX9的3’UTR区抑制SOX9的表达.研究结果表明miR-101通过靶向抑制SOX9的表达在体内和体外调节人神经胶质瘤的增殖、迁移和侵袭,说明miR-101是未来神经胶质瘤治疗的潜在靶标.

肝纤维化治疗的新视角: 靶向巨噬细胞代谢

肝纤维化是由多种病因引起的细胞外基质过度累积,导致纤维瘢痕形成的病理过程。目前,病因治疗(如有效的抗病毒治疗)仍是肝纤维化的主要治疗策略。肝巨噬细胞作为肝纤维化的核心参与者,影响肝纤维化的进展与消退,被认为是肝纤维化治疗的重要靶点。近年来,随着免疫代谢领域的进展,代谢重编程已成为决定巨噬细胞结局和推动疾病发展的关键因素。本文综述了肝纤维化过程中巨噬细胞的作用及其代谢变化,并讨论靶向巨噬细胞代谢的抗纤维化潜力,为肝纤维化的发生、发展和治疗提供新的思路.