山姜素在人肝微粒体的葡萄糖醛酸化反应研究

目的研究体外肝微粒体孵育体系中山姜素的葡萄糖醛酸化代谢情况,鉴定参与山姜素葡萄糖醛酸化代谢的UGT亚型。方法用体外肝微粒体孵育体系,用HPLC-UV检测方法,检测山姜素的葡萄糖醛酸化代谢情况。将代谢产物进行纯化后,用质谱(MS)和核磁共振(NMR)法进一步鉴定其结构。用商业化重组表达的UGT单酶,鉴定代谢产物的结构和归属可能参与山姜素葡萄糖醛酸化代谢反应的葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)亚型。结果山姜素葡萄糖醛酸代谢产生一个代谢产物,经结构鉴定为山姜素-氧-单葡萄糖醛酸化产物。人肝微粒体代谢山姜素的动力学行为,符合米方程且动力学参数:Vmax=(101.9±3.0)nmol·min-1·mg-1·pro,Km=(40.6±3.6)μmol·L-1。UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9和UGT2B15均参与了山姜素的葡萄糖醛酸化反应。结论山姜素在人肝微粒体孵育体系中会被代谢成为一个单葡萄糖醛酸化产物,且归属了参与的UGT酶。

磁性纳米粒子-抗体复合物分离肝癌线粒体

目的利用人肝癌组织,研究磁性纳米粒子-抗体复合物与传统线粒体分离方法之间的差异。方法取人肝癌组织,分别采用磁性纳米粒子-抗体复合物和密度梯度离心方法分离线粒体。扫描电镜观察线粒体形态,Westernblot检测线粒体蛋白标志物,流式细胞仪分析线粒体膜电位变化。结果采用磁性纳米粒子-抗体复合物方法分离得到的肝癌组织线粒体结构完整,无胞核、胞膜等组分的污染,几乎没有过氧化物酶体和溶酶体的污染。经流式细胞仪检测,线粒体膜电位稳定。结论与传统方法相比,磁性纳米粒子-抗体复合物分离方法具备简便易行,分离得到的线粒体结构完整、纯度及活性较高,并且不需要大型设备等优点。

δ阿片受体激动剂D-丙2，D-亮5脑啡肽通过蛋白激酶C途径抑制人肝癌HepG2细胞增殖并增强其对顺铂的敏感性

目的研究8阿片受体激动剂D-丙2，D-亮5脑啡肽（DADLE）对人肝癌HepG2细胞增殖的影响，并探讨其与蛋白激酶C（PKC）途径的关系。方法分别以0．01、0．1、1．0和10μmol／L的DADLE处理HepG2细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（Mar）法检测细胞的增殖活性，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot法检测PKCmRNA和P—PKC蛋白的表达。分别以DADLE＋纳曲吲哚（NAL）或佛波酯（PMA）处理HepG2细胞，采用流式细胞仪观察细胞周期，Mar法检测细胞的增殖活性，Westernblot法检测p-PKC蛋白的表达。以DADLE＋顺铂处理HepG2细胞，MTT法检测HepG2细胞的生长抑制率。结果不同浓度的DADLE通过抑制HepG2细胞中PKCmRNA和P—PKC蛋白的表达对HepG2细胞的增殖发挥抑制效应。流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，DADLE处理组HepG2细胞中S＋G2／M期细胞的比例降低了3．94％（P〈0．01）；给予NAL或PMA处理后，S＋G2／M期细胞的比例分别增加了3．22％和3．63％（P〈0．01）。MTT法和Westernblot法检测结果显示，与对照组相比，DADLE处理组HepG2细胞的A570nm值和P-PKC蛋白的表达显著下降（P〈0．01）；给予NAL或PMA处理后，HepG2细胞的A570nm值和p-PKC蛋白的表达明显升高（P〈0．01）。DADLE＋顺铂处理组HepG2细胞的生长抑制率为79．9％，显著高于DADLE处理组（25．2％）和顺铂处理组（43．2％，P〈0．01）。结论DADLE激活8阿片受体对人肝癌HepG2细胞的增殖具有抑制作用，其机制与PKC途径相关。DADLE可增强HepG2细胞对顺铂的敏感性。

δ阿片受体激活通过蛋白激酶C途径抑制人肝细胞凋亡

目的研究δ阿片受体激活对人肝细胞凋亡的抑制作用并探讨其与蛋白激酶C（PKC）途径的关系。方法体外培养人肝细胞，用MTT法检测细胞存活率；AnnexinV—FITC／PI双标记法检测细胞凋亡率；流式细胞仪分析细胞周期；RT—PCR检测PKC的mRNA表达；Westernblot分析PKC、Caspase-3蛋白的表达。结果体外培养的人肝细胞经血清剥夺48h后可发生明显的凋亡。激活δ阿片受体可显著抑制这一现象，细胞凋亡率降低（8．37±0．47）、Caspase-3蛋白表达减少（0．147±0．042）、PKC蛋白表达增加（O．698±0．130）。给予PKC拮抗剂GFl09203X后，δ阿片受体抑制细胞凋亡的作用显著下降（20．66±0．60）。结论激活肝细胞膜上的δ阿片受体对血清剥夺导致的人肝细胞凋亡具有抑制作用，其作用机制与PKC通路相关。