hnRNPU基因敲减小鼠preB A70细胞株的构建及鉴定

目的构建shRNA-不均一核糖核蛋白U(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U,hnRNPU)慢病毒表达载体以及hnRNPU基因稳定敲减的小鼠preB A70细胞株。方法将靶向小鼠hnRNPU基因的shRNA干扰序列连接入pLKO.1-EBFP-PURO质粒中,测序检测。将构建成功的pLKO.1-hnRNPU shRNA-EBFP-PURO和慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,收集病毒上清。将病毒上清感染A70细胞,利用倒置荧光显微镜观察病毒感染情况,利用Western blot检测hnRNPU蛋白的表达。通过有限稀释方法,构建单细胞克隆,并利用Western blot筛选hnRNPU基因稳定敲减的A70细胞株。结果成功构建了shRNA-hnRNPU慢病毒表达载体。表达shRNA-hnRNPU的慢病毒在HEK293T细胞中完成包装。包装好的病毒感染A70细胞72 h后,细胞内可以观察到蓝色荧光。感染后的细胞经过嘌呤霉素筛选后,细胞内的hnRNPU蛋白大约减少一半。通过有限稀释方法,构建了hnRNPU基因稳定敲减的细胞株。结论本研究成功构建了hnRNPU稳定敲减的A70细胞株,为后续研究hnRNPU在早期B细胞发育中的作用奠定了实验基础。