氟砷联合染毒对成骨与破骨细胞共培养体系中TRAF-6/NF-κB1/NFATc1/TRAP mRNA表达的影响

[目的]探讨氟、砷及氟砷联合染毒对小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1与小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7共培养体系中肿瘤坏死因子相关受体因子6(TRAF-6)、核因子κB1(NF-κB1)、活化T细胞核因子1(NFATc1)及抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)mRNA表达的影响。[方法]用成骨诱导剂诱导后的小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1与单核巨噬细胞RAW 264.7细胞建立共培养体系,培养7 d后,用TRAP染色鉴定破骨细胞。采用CCK-8法测定氟、砷不同浓度染毒对细胞增殖的影响,从而确定最终的实验染毒浓度。在共培养体系中,换用含不同浓度的氟化钠(0、0.1、0.4、1.6 mmol/L NaF,记为F0、F0.1、F0.4、F1.6)、亚砷酸钠(0、0.5、2.5、12.5μmol/L NaAsO_2,记为As0、As0.5、As2.5、As12.5)以及氟砷联合(上述剂量两两组合)的培养基分别培养24 h,实时荧光定量PCR法检测各染毒组TRAF-6、NF-κB1、NFATc1及TRAP mRNA的表达水平。[结果]成骨细胞与RAW 264.7细胞共培养7 d后,经TRAP染色可见细胞发生融合,体积变大,多核,说明RAW 264.7细胞已分化为多核的破骨细胞。氟单独染毒,与对照组比较(1.00±0.08、1.00±0.04、1.00±0.02、1.00±0.19),F1.6染毒组的TRAF-6、NF-κB1、NFATc1及TRAP mRNA表达水平均明显增加(1.74±0.16、2.04±0.09、1.33±0.06、3.24±0.29),差异均有统计学意义(P <0.05)。砷单独染毒,As12.5染毒组的TRAF-6和TRAP mRNA表达(1.24±0.06和1.26±0.08)高于对照组(1.00±0.08和1.00±0.19),而NF-κB1和NFATc1 mRNA表达(0.61±0.05和0.60±0.06)在As12.5组均低于对照组(1.00±0.04和1.00±0.02),差异均有统计学意义(P <0.05)。氟砷联合染毒,与F0.1组相比(0.80±0.02和0.59±0.03),NF-κB1和NFATc1的表达在F0.1As12.5组增加(1.11±0.02和1.07±0.05,P <0.05),但均低于氟、砷单独染毒之和;与F0.4比较(2.85±0.13,1.11±0.04,1.09±0.03),TRAF-6、NF-κB1和NFATc1表达在F0.4As12.5组降低(1.38±0.11,0.87±0.03和0.44±0.03,P <0.05);与F1.6比较(2.04±0.09和3.24±0.29),NF-κB1和TRAP mRNA表达在F1.6As12.5组均降低(1.24±0.07和2.09±0.22,P <0.05);与As0.5、As12.5组相比,TRAF-6、NF-κB1、NFATc1及TRAP mRNA在F1.6As0.5组和F1.6As12.5组表达均增加(P <0.05),但均低于氟、砷单独染毒之和。氟、砷对TRAF-6、NF-κB1、NFATc1及TRAP mRNA表达均有主效应作用(F=437.22、657.76、321.89及187.11;F=123.08、170.53、78.99及74.08,均P <0.05);氟砷联合染毒对TRAF-6、NF-κB1、NFATc1及TRAP mRNA表达存在交互作用(F=153.76、97.14、100.31、46.78,均P <0.05)。[结论]高氟可促进成骨细胞与破骨细胞共培养体系中TRAF-6、NF-κB1、NFATc1及TRAP mRNA的表达,从而达到增加破骨细胞分化成熟及骨吸收活性,氟、砷对共培养体系中各基因指标的影响均有主效应作用,氟砷联合染毒对共培养体系中相关基因表达的交互作用主要表现为砷对氟的拮抗作用。

氟砷联合染毒对OPG/RANKL调节破骨细胞分化的影响

目的探讨成骨细胞(osteoblasts,OB)与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7共培养体系中氟砷联合染毒对骨保护素(OPG)与核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)调节破骨细胞分化的影响。方法用成骨诱导剂诱导小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1与RAW264.7细胞建立共培养体系,培养7 d,分别用不同浓度的氟化钠(0、0.1、0.4、1.6 mmol/L NaF)、亚砷酸钠(0、0.5、2.5、12.5μmol/L NaAsO2)以及不同剂量的氟砷联合培养基培养24 h,根据2×4析因实验设计,将染毒细胞分为对照组、0.1 mmol/L NaF、0.4 mmol/L NaF、1.6 mmol/L NaF、0.5μmol/L NaAsO2、2.5μmol/L NaAsO2、12.5μmol/L NaAsO2、0.1 mmol/L NaF+0.5μmol/L NaAsO2、0.1 mmol/L NaF+2.5μmol/L NaAsO2、0.1 mmol/L NaF+12.5μmol/L NaAsO2、0.4 mmol/L NaF+0.5μmol/L NaAsO2、0.4 mmol/L NaF+2.5μmol/L NaAsO2、0.4 mmol/L NaF+12.5μmol/L NaAsO2、1.6 mmol/L NaF+0.5μmol/L NaAsO2、1.6 mmol/L NaF+2.5μmol/L Na AsO2、1.6 mmol/L NaF+12.5μmol/L NaAsO2。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中OPG和RANKL蛋白的表达,实时荧光定量PCR法检测各组OPG和RANKL mRNA的表达。结果与对照组相比,不同剂量的氟和砷单独染毒降低OPG蛋白的表达(P<0.05),而不同剂量的氟和砷单独染毒增加RANKL蛋白的表达(P<0.05);氟砷联合染毒显示,0.4 mmol/L NaF+12.5μmol/L NaAsO2组与0.4 mmol/L NaF相比,OPG蛋白表达降低(P<0.05);1.6 mmol/L NaF+12.5μmol/L NaAsO2与1.6 mmol/L NaF相比,OPG蛋白表达降低(P<0.05)。OPG蛋白表达在0.1 mmol/L NaF+0.5μmol/L NaAsO2和0.4 mmol/L NaF+0.5μmol/L NaAsO2组高于0.5μmol/L NaAsO2组(P<0.05),但低于氟、砷单独染毒之和;分别与2.5、12.5μmol/L NaAsO2组相比,OPG蛋白在1.6 mmol/L NaF+2.5μmol/L NaAsO2组和1.6 mmol/L NaF+12.5μmol/L Na AsO2组明显降低(P<0.05)。在0.1、0.4、1.6 mmol/L NaF组中,随着砷染毒浓度的增加,RANKL蛋白表达均受到抑制,除了在0.4 mmol/L NaF+0.5μmol/L NaAsO2组和1.6 mmol/L NaF+2.5μmol/L NaAsO2组表达无明显差异(P>0.05)外,其余各联合组的表达均低于各自氟单独染毒组(P<0.05),且也低于氟、砷单独染毒之和。在0.5、2.5、12.5μmol/L NaAsO2组中,随着氟染毒浓度增加,RANKL蛋白表达均受到抑制,除了在0.4 mmol/L NaF+0.5μmol/L NaAsO2组、1.6mmol/L NaF+2.5μmol/L NaAsO2组及0.1 mmol/L NaF+12.5μmol/L NaAsO2组无明显差异(P>0.05)外,其余各联合组表达均低于各自砷单独染毒组(P<0.05);且所有联合组均低于氟、砷单独染毒之和。OPG和RANKL m RNA与其蛋白表达的变化趋势基本一致。氟对OPG、RANKL蛋白表达有主效应作用(F=7.57、7.38,P<0.05);砷对OPG、RANKL蛋白表达也有主效应作用(F=19.86、10.22,P<0.05);在氟砷联合染毒对OPG和RANKL蛋白表达存在明显的交互作用(F=4.93,11.61,P<0.05)。结论在共培养体系中,氟、砷染毒均可通过降低OPG同时上调RANKL的表达来调节OPG/RANKL的比例,增加OC的分化成熟,从而使得骨吸收功能增强。氟砷联合染毒对OPG和RANKL表达的交互作用主要表现为拮抗。

氟砷联合染毒对大鼠牙齿组织BMP-2、RANK、PI3K、Akt1基因转录水平的影响

[目的]通过建立慢性氟砷联合染毒大鼠模型,观察骨形态发生蛋白2(BMP-2)、核因子κB受体活化因子(RANK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B1(Akt1)基因mRNA相对表达水平在氟砷联合染毒大鼠牙齿组织中的变化情况。[方法]选取清洁级Wistar大鼠作为研究对象,按析因设计随机分为16组,每组10只,雌雄各半,采用不同浓度Na F(0.0、5.0、10.0、20.0 mg/kg)和Na As O2(0.0、2.5、5.0、10.0 mg/kg)单独和联合灌胃染毒,每周连续灌胃染毒6 d,停灌1 d,连续染毒6个月。实验结束后处死大鼠。采用氟离子选择电极测牙氟含量,原子荧光光谱法测牙砷含量,实时荧光定量PCR检测大鼠牙齿组织BMP-2、RANK、PI3K和Akt1mRNA相对量表达。[结果]无氟染毒的4组大鼠均无氟斑牙发生,余12组大鼠均出现氟斑牙。牙氟、牙砷含量随单独氟、砷染毒剂量升高而增加。大鼠牙齿组织BMP-2和Akt1mRNA表达水平呈现随氟染毒剂量增加而升高的趋势(P<0.05),但并未随砷染毒剂量的改变而发生变化(P>0.05)。RANK和PI3K mRNA表达水平呈现随氟染毒剂量增加而下降的趋势(P<0.05),各砷染毒剂量组间差异则无统计学意义(P>0.05)。氟染毒剂量、牙氟含量与BMP-2和Akt1mRNA表达水平呈正相关(r=0.382、0.302,0.292、0.246,均P<0.05),与RANK和PI3K mRNA表达水平呈负相关(r=-0.323、-0.332,-0.193、-0.185,均P<0.05),氟斑牙与牙齿组织RANK、PI3K mRNA表达呈负相关(r=-0.283、-0.273,均P<0.05),其余无相关性。[结论]过量氟暴露可上调大鼠牙组织BMP-2和Akt1转录水平,下调RANK和PI3K转录水平,从而参与牙齿釉质发育或矿化过程,导致牙齿损伤。氟砷联合暴露致牙齿损伤主要表现为氟的主效应,砷间接参与氟致牙齿损伤作用。

氟砷联合对成骨与破骨细胞共培养体系中TRAF-6介导的NF-κB1信号通路相关蛋白表达的影响

目的探讨氟、砷及氟砷联合染毒对小鼠成骨细胞MC3T3-E1与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7共培养体系中肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF-6)/核因子κB1(NF-κB1)信号通路中相关蛋白表达的影响.方法MC3T3-E1细胞经成骨诱导剂诱导后与RAW264.7细胞建立共培养体系,体外培养7d,采用析因设计,分别用不同剂量的氟化钠(0.0、0.1、0.4、1.6 mmol/L NaF,F)、亚砷酸钠(0.0、0.5、2.5、12.5μmol/L NaAsO2,As)以及不同剂量的氟砷联合培养基培养24h.采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测核因子κB受体活化因子(RANK)、TRAF-6、NF-κB1、T细胞活化因子(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的蛋白表达水平.结果氟单独作用时,与对照组(F0.0As0.0,1.00±0.00)比较,各剂量组RANK、NF-κB1、TRAP蛋白表达(1.11±0.04、1.29±0.05、1.38±0.04,1.24±0.04、1.13±0.03、1.34±0.05,1.12±0.03、1.24±0.04、1.61±0.06)增加(P均<0.05);TRAF-6蛋白表达在F01和F1.6组(1.23±0.04、1.35±0.03)增加(P均<0.05).砷单独作用时,与对照组(F0.0As0.0)比较,RANK、TRAF-6、NF-κB1蛋白表达在As0.5组增加(P均<0.05),RANK和NFATc1蛋白表达在As12.5组减少(P均<0.05).氟砷联合作用时,同一染氟剂量,RANK蛋白表达在F0.1As0.5组,TRAF-6蛋白表达在F0.1As12.5、F0.4As0.5、F04As2.5组,NF-κB1蛋白表达在F0.1As0.5、F0.4As2.5、F0.4As12.5组,NFATc1蛋白表达在F0.1As0.5、F0.4As0.5组,TRAP蛋白表达在F0.1As12.5组均高于相应的单独氟染毒组(F01、F04,P均<0.05),但低于氟、砷单独染毒之和.同一染砷剂量,RANK蛋白表达在F0.1As12.5组,TRAF-6蛋白表达在F0.1As12.5、F0.4As2.5组,NF-κB1蛋白表达在F0.1As12.5、F0.4As2.5、F0.As12.5、F1.6As2.5组,TRAP蛋白表达在F1.6As2.5、F1.6As12.5组均高于相应的单独砷染毒组(As2.5、As12.5,P均<0.05),但低于氟、砷单独染毒之和.氟对RANK、TRAF-6、NF-κB1、NFATc1、TRAP蛋白表达均有主效应作用(F=3.41、341.73、66.01、56.49、147.40,P均<0.05);砷对各蛋白指标也均有主效应作用(F=686.71、174.96、107.32、235.80、331.37,P均<0.05);氟砷联合作用对各蛋白指标均有交互作用(F=50.39、234.94、116.72、67.77、36.56,P均<0.05).结论在MC3T3-E1与RAW264.7细胞的共培养体系中,氟可激活TRAF-6介导的NF-κB1信号通路相关蛋白表达,从而促进破骨细胞分化;砷对相关蛋白表达作用不完全一致.氟砷联合染毒对TRAF-6介导的NF-κB1信号通路相关蛋白表达的交互作用主要表现为拮抗作用.