在明串珠菌构建高产甘露醇的细胞工厂

甘露醇是一种具有多种功效的六糖醇,被广泛应用于医药、食品、化工和电子等行业。为构建高产甘露醇的明串珠菌,建立了将底盘细胞转化为高产目标产物菌株的理论:细胞工厂的“源-库”学说。通过2次同源重组,打破染色体中基因的操纵子和重叠基因模式,并将甘露醇外排泵蛋白(mannitol efflux pump,MEP)基因序列和再生NADH的酶(甲酸脱氢酶)基因序列定点插入到染色体上。蔗糖为90 g/L时,打破mep基因的操纵子和重叠基因模式的菌株甘露醇产量比原始菌株(CGMCC1.10327)提高了9.5%。原始菌株染色体上敲入一个拷贝mep基因序列的菌株,底物蔗糖能添加到120 g/L,甘露醇产量也达到55.18 g/L。CCTCC M2020762菌株染色体上敲入一个拷贝甲酸脱氢酶基因序列的菌株,底物蔗糖能添加到145 g/L,甘露醇产量也达到101.6 g/L。使细胞工厂具备更强的“源”能(NADH再生等)和更大的“库”容(提高MEP活性),实现目标产物的超高产。

以蔗糖为原料明串珠菌发酵生产甘露醇

肠膜明串珠菌CGMCC 1.10327为发酵菌株,质量浓度为2%的蔗糖为底物,采用分批发酵,研究甘露醇的生成。为了优化甘露醇的生成,分别考察了添加5 g/L的葡萄糖、3种盐(K2HPO4、乙酸钠、柠檬酸铵)、不同的初始pH和加入0.2%的CaCO3对产甘露醇的影响。结果表明,葡萄糖的加入有助于提高甘露醇的产量。3种盐(K2HPO4、乙酸钠、柠檬酸铵)对甘露醇的生成有明显的影响,当分别为2 g/L、5 g/L和2 g/L时,甘露醇的产量最高。最佳的初始pH=6。向培养基中加入0.2%的CaCO3,甘露醇的产量明显的降低。

辣白菜中分离含内源性质粒的魏斯氏菌及其鉴定

为了探讨魏斯氏菌在辣白菜中起的作用和获得与明串珠菌相关乳酸细菌的质粒,从辣白菜中分离了魏斯氏菌。辣白菜是朝鲜民族的传统食品,在低温条件下大白菜经过乳酸细菌发酵而成的。将辣白菜汁液均匀涂布在含2%(m/v)CaCO3的MRS平板上,30℃恒温培养箱中培养24h～36h,在中国内地首次分离获得了魏斯氏菌。通过对该菌进行镜检、生理生化特性检测以及16S rDNA序列的系统发育树分析确定其分类地位。结果表明其属于Weissella cibaria,命名为kimshi006,在NCBI上的登录号为HM369807。这一魏斯氏菌菌株含有2条内源性质粒,其大小分别为大约3000bp和8000bp。

辣白菜中明串珠菌的筛选及鉴定

从辣白菜中分离筛选益生菌-明串珠菌。通过对其生理生化特性的研究以及16S rDNA序列的系统发育树分析确定其分类地位。结果表明属于肠膜明串珠菌,命名为kimshi 001,在NCBI上的登录号为FJ655776。

微生物发酵合成γ-氨基丁酸的研究进展

γ-氨基丁酸是一种用于医药、食品中的新型功能性因子,由于化学合成法和植物富集法具有明显的缺点,因此微生物发酵合成γ-氨基丁酸成为目前研究的热点。该研究论述了产GABA的微生物、其培养基优化和诱变育种以及谷氨酸脱羧酶基因的研究进展。

球毛壳菌部分表达序列标签的生物信息分析

球毛壳菌属于子囊菌门，是一种植物病害的广谱生物防治菌。为了解球毛壳菌的遗传背景和为生产上的应用打下基础，构建了球毛壳菌菌丝体的cDNA文库。测序产生了3507个可读序列，进一步分析时去掉小于100bp的短序列。用phrap软件对所获得的3116个表达序列标签(EsT)进行拼接，生成387个contigs和1023个singlets。BLAST分析表明513个单一基因是已知基因，897个单一基因代表新基因。通过E-mail从国际DNA数据库(DDBJ)取得了1410条序列的登录号。从已知基因中鉴定了3类生物防治相关基因。研究结果表明，利用EST途径鉴定球毛壳菌的基因是非常有效的，而且能为生物防治分子机理和生物防治基因表达产物生产技术的研究提供重要线索。

球毛壳菌几丁质酶3基因的序列分析

根据EST分析的结果 ,从cDNA文库中挑取几丁质酶 3基因的克隆进行了测序并序列分析。结果表明 :cDNA文库中几丁质酶 3基因的克隆插入片断大小为 12 6 8bp;用Phrap软件拼接出来的几丁质酶 3的表达序列标签拼接序列与实际序列不完全吻合。因此 ,在EST分析中不用Phrap软件为好。

可见光分光光度法测定米曲霉发酵液中总黄酮

米曲霉可发酵生产黄酮类物质,为确定发酵液中总黄酮含量,采用可见光分光光度法(A510)进行测定,并优化了测定条件。确定乙醇浓度为95%(体积分数),亚硝酸钠浓度为4%(质量分数),硝酸铝浓度为10%(质量分数)以及氢氧化钠浓度为4%(质量分数)时最适用于米曲霉发酵液中总黄酮含量的测定。最后分别用芦丁和槲皮素物质的量为标准确定总黄酮含量。

土壤中明串珠菌的筛选与鉴定

从土壤中分离筛选明串珠菌,通过对其生理生化特性的研究并基于16S rDNA序列的系统发育树分析确定其分类地位。结果该菌株为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、精氨酸和七叶苷水解阴性、发酵葡萄糖产酸产气、不生成葡聚糖。可发酵利用果糖、蔗糖、蜜二糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、棉籽糖、核糖、水杨苷,延迟利用半乳糖和甘露糖,微弱利用纤维二糖、乳糖、海藻糖和L-鼠李糖,不可利用甘露醇;系统发育树表明该菌株属于假肠膜明串珠菌,命名为kimshi005,在GenBank上的登录号为GU130195。

明串珠菌发酵产甘露醇的研究进展

明串珠菌是韩国泡菜、德国泡菜和腌菜等发酵蔬菜中的优势细菌,保持产品的质量中起着重要作用,在各种乳制品中也有其的应用,因此近年来在内地对其的研究开始活跃。明串珠菌的发酵产甘露醇实现大规模工业化的潜力非常大,因此主要论述了明串珠菌的甘露醇转化及相关代谢、发酵产甘露醇的研究。

球毛壳菌(Chaetomium globosum)cDNA文库的构建

以质粒pBluesciptIIsk( +)为载体,以E. coliDH5α为受体菌,通过加接头定向克隆的方法构建了球毛壳菌的cDNA文库. 该文库的滴度为 2. 25×l04pfu/ml, 重组率为 96. 4%.

大孔吸附树脂对辣椒素类似物的富集

为纯化发酵产物,用大孔吸附树脂对辣椒素类似物进行富集。通过静态吸附解吸附试验,筛选一种性能较好的树脂。进一步研究该树脂对辣椒素类似物的动态吸附与解吸性能,并确定其最优条件。富集后溶液中辣椒素类似物的含量提高约1.8倍。

明串珠菌电转化的优化

为了构建食品级基因工程受体菌,课题对明串珠菌的电转化条件进行了优化。以大肠杆菌-明串珠菌穿梭质粒pCW4为载体,以明串珠菌为受体,文章优化了细胞壁处理方式、电击参数、复苏时间等与电转化相关的因素。结果表明:用氨苄浓度0.7μg/mL的MRS培养基培养明串珠菌至OD600为0.5左右,以PBS作缓冲液,收获制成感受态细胞,与1μg DNA混合,在电场强度12kV/cm、电阻200Ω、电容25μF下电击转化,以含80mmol/L MgCl2的MRS培养基复苏培养3h,得到最高的转化效率为1.75×105 cfu/μg DNA。

辣椒素发酵产物对小鼠营养性肥胖的预防作用

目的:研究辣椒素发酵产物对小鼠营养性肥胖的预防效果。方法:小鼠始终饲喂高脂饲料,并以灌胃方式给药,观测体重、Lee’s指数、脂肪组织湿重、脂肪细胞数目和大小及血清总胆固醇和甘油三酯等指标。结果:除血糖外给药组小鼠各项指标与对照组相比均有统计学差异。结论:辣椒素发酵产物对小鼠营养性肥胖有预防作用。

提取明串珠菌质粒方法的优化

明串珠菌的基因操作在食品发酵工业和改善食品产品研发中具有很多潜在的应用价值。明串珠菌质粒可以构建成为乳酸细菌的载体。采用普通的方法提取明串珠菌质粒效果不佳,因此以O'sullivan的方法为基础,对提取明串珠菌质粒的流程进行了优化。结果表明,采用6mL菌液和分别为800,1600,1200μL的3种提取液,用STE去除杂质,用试剂盒离心柱纯化,从而获得的质粒DNA的量较大,纯度较高。

辣椒素类似物发酵转化的条件优化

将辣椒素类物质经液体发酵转化为低辣度的辣椒素类似物。研究了培养基组成和培养条件对发酵的影响,确定最优发酵转化条件为采用微波预处理结合乙醇萃取方法提取辣椒素类物质,用具有5%乙醇耐受性的明串珠菌进行发酵,辣椒素类物质转化率可以达到30%左右。

微生物学实验“培养基的配制”中存在的问题与解决方法

在微生物学实验中方方面面都涉及到培养基的制备。因此,先详述了制备微生物培养基的流程,然后针对多年在教学实践中发现的问题,在8个方面提出了解决方案。只要在配制培养基的过程中注意这些细节,微生物实验就会得到很好的效果。

在明串珠菌中构建葡萄糖到甘露醇的转化体系

为了进一步提高甘露醇产量,在明串珠菌构建了葡萄糖到甘露醇的转化体系。通过2次同源重组,将mt1d-m1p表达盒串联体定点插入到染色体上。以90g/L蔗糖为底物时,野生型菌株的甘露醇产量为31.48g/L,Δaldh::(mt1d-m1p)为42.63g/L,Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy为43.47g/L,Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::(mt1d-m1p)为45.74g/L,Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)为47.26g/L。增加甘露醇的合成途径是增产的手段之一。

球毛壳菌循环肽HC-毒素基因的序列分析

为了验证Phrap软件是否适合在EST分析中应用 ,对球毛壳菌循环肽HC -毒素基因进行了序列分析。根据EST分析的结果 ,从cDNA文库中挑取循环肽HC -毒素基因的克隆进行了测序并序列分析。结果表明cDNA文库中循环肽HC -毒素基因的克隆插入片断大小为 12 17bp ;用Phrap软件拼接出来的循环肽HC -毒素的表达序列标签拼接序列与实际序列不完全一致 ,因此Phrap软件不适合在EST分析中应用。

纳豆激酶基因的克隆与表达

利用ＰＣＲ方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组ＤＮＡ 中扩增得到了纳豆激酶基因，并测定其核苷酸序列．利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达．ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳表明，表达蛋白占菌体蛋白的１５．２％ ，琼脂糖－纤维蛋白平板法测出表达产物具有溶解血栓活性．