人血清脂联素定量ELISA检测方法的建立及初步临床应用

目的:建立一种检测人血清中脂联素(APN)的酶联免疫吸附方法(ELISA),并初步探讨其在冠心病诊断中的应用。方法:构建表达质粒pET22b(+)/gAPN,在原核表达系统大肠杆菌中表达并纯化重组脂联素球状区(gAPN)蛋白。用抗APN单克隆抗体MAB10651包被微孔板,10%小牛血清作为封闭液,针对APN不同抗原表位的单克隆抗体MAB1065生物素化后作为标记抗体,联合生物素-亲和素信号放大系统,以gAPN重组蛋白为标准品绘制标准曲线,以准确性、特异性、重复性、回收率试验和方法对比试验评价ELISA方法。检测161例冠心病患者血清APN水平并结合冠状动脉造影结果和Gensini积分系统,探讨血清APN水平与冠心病的关系。结果:利用基因克隆技术成功构建了pET22b(+)/gAPN质粒,获得了相对分子质量约15000的重组gAPN蛋白,产量较高(1.57mg),纯度>90%,并以此为标准品初步建立了检测人血清APN的定量ELISA方法。该法具有良好的准确性和重复性,灵敏度达150pg/ml,回收率为91.0%～108.0%,与深圳依诺金生物科技有限公司进口分装的ELISA试剂盒对照比较有良好的相关性(r=0.935,P<0.001)。临床检测表明冠心病组血清APN水平明显低于非冠心病组(P<0.01),且血清APN水平随冠状动脉狭窄程度的加重呈进行性下降趋势。结论:本实验成功建立了一种简便快速检测人血清APN的ELISA方法,对诊断冠心病有临床应用价值,为国内APN诊断试剂盒的研制和开发提供了科学实验依据。

利用Agilent定制基因芯片筛选相同病理类型、不同预后的早期乳腺癌的分子标记物

目的分析相同病理类型、临床分期（I～Ⅱ期）但预后不同的乳腺癌组织的基因表达差异，筛选出有意义的基因组合，寻找与乳腺癌预后相关的基因，探索可以早期预测乳腺癌预后的基因分型诊断标准。方法用Agilent定制人8×15000芯片对筛选出的实验组8例早期乳腺癌患者的组织标本，结合其预后数据，进行差异基因表达分析；采用Real．timePCR技术，在同期收集的验证组42例乳腺癌样本中对差异表达的基因进行验证。结果基因芯片检测分析发现，实验组预后差样本比预后好样本有差异表达基因132个，其中44条基因显著上调，88条基因显著下调（差异均在2倍以上）。结论相同病理类型、临床分期、不同预后的早期乳腺癌组织中基因表达存在显著差异，CD44、MK167、NTRK2、Nek2、C160rf60、TOP2A、ANCCA、RRM2等8个基因可以作为早期乳腺癌预后预测基因标记物。

利用绿色荧光蛋白建立包涵体变-复性新方法

为提高常规稀释复性方法的复性效率,以重组绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)包涵体为模型,开发一种新的双变性-稀释复性方法。新方法选取含有精氨酸的碱性复合溶液作为第一变性剂溶解GFP包涵体,通过梯度降低变性液的酸碱度析出溶解目的蛋白,再以尿素为第二变性剂溶解析出的蛋白,随后进行稀释复性。结果显示:与常规方法比,新方法复性的绿色荧光蛋白活性收率提高至1.5～2.3倍,复性蛋白对温度、溶液酸碱度及变性剂的稳定性提高。增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP)及其融合蛋白的包涵体采用新方法进行复性,均取得80%以上的活性回收率,说明新方法对GFP系列融合蛋白的包涵体具有一定的适用性。新方法从变性剂使用与包涵体结构的关系出发,突破常规操作中变性剂单次使用的局限,既保留了简便性又提高了常规稀释复性方法的效率。

饮用水处理中活性炭吸附卤乙酸的特性

采用静态和动态试验研究了活性炭对卤乙酸的物理吸附特性．静态试验表明：在单吸附质条件下，二氯乙酸和三氯乙酸的吸附等温线在低浓度区（ｃｅ＜５０μｇ／Ｌ）表现为单层吸附，在高浓度区表现为多层吸附．活性炭对三氯乙酸的吸附能力高于二氯乙酸．在饮用水处理常见的浓度范围内，活性炭对三氯乙酸的吸附容量约为二氯乙酸的２倍．在多吸附质条件下，对三氯乙酸的吸附容量只略有降低，对二氯乙酸的吸附容量则显著下降，这与有机物的结构特性相符合．动态试验表明：在物理吸附作用下，当进水中二氯乙酸与三氯乙酸的浓度相近时，二氯乙酸为工艺的控制化合物．当进水中２者浓度均为１０μｇ／Ｌ时，活性炭床的穿透时间最长分别为１０９４ｄ和４６２ｄ．现行水厂中运行的活性炭柱吸附饱和分数在９２％以上．

控制饮用水处理工艺及配水管网中卤乙酸的研究

研究了北京市第九水厂处理工艺过程中卤乙酸的去除特性，并测定了五个水厂配水管网中卤乙酸的变化情况。结果表明：①传统水处理工艺对卤乙酸的去除率仅在２０％以下；活性炭对卤乙酸的去除效果较好，不同运行时期的炭床对其进水中的卤乙酸去除率为５０％～８５％，去除的卤乙酸占预氯化后水厂进水中卤乙酸总量的４０％～７０％，其去除作用包括活性炭的吸附和炭床中的生物分解，两者所去除的卤乙酸量基本相同。②配水管网中影响卤乙酸变化的因素较多，如清水池停留时间较短，出水余氯较高，则可能在管网前部继续生成卤乙酸，使其浓度升高；在管网末梢，余氯较低，在微生物的作用下卤乙酸浓度将降低。

用CBMN法评价饮用水处理流程中有机提取物的细胞毒性

利用ＣＨＯ细胞胞质分裂阻断微核（ＣＢＭＮ）法，对某自来水厂７个处理工艺流程水中的有机提取物的细胞毒性进行了评价．在实验剂量范围内，比较了各样品的含微核的双核细胞率（ＢＮＭＮ）、核分裂指数（ＮＤＩ）和胞质分裂阻断增殖指数（ＣＢＰＩ）．实验表明，源水加氯后比源水的细胞毒性增大；经机加池和煤砂滤池处理后的水样毒性较大，其中煤砂滤池水毒性最大，机加池水次之；经炭吸附后的水样比炭吸附前水样的毒性下降；管网水的毒性较低．

禽肉产品中禽流感与新城疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-PCR一致,mRT-PCR检测新城疫的敏感性较sRT-PCR敏感性下降2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR仅检测到不同亚型(H1、H3、H5、H6和H9)禽流感、不同毒力新城疫病毒,对其他9种禽病原体和SPF鸡尿囊液均未扩增出片断。mRT-PCR检测39株禽流感H1、H5和H9亚型病毒、41株不同宿主源新城疫病毒,结果与sRT-PCR、HI试验完全一致;mRT-PCR和病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,2种方法检测禽流感的符合率为93.8%(30/32),检测新城疫的符合率为95.2%(20/21);采用mRT-PCR和病原分离法同时对35份进口禽产品、32份鸡粪拭子检测,2种方法检测禽流感的符合率为100%(67/67),对新城疫的符合率为97.1%(65/67)。病原分离法的检出率虽高于mRT-PCR,经统计学分析,两者差异不显著。

霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列的测定与分析

测定并分析了霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列,为VP2生物学特性和功能研究提供分子遗传学基础。为此构建了VP2DNA随机文库,鸟枪法(shot gun)测定其全基因组序列。测序结果用软件Phrad Prap拼接成最小重叠群(contig),引物步移法测定contigs间的缝隙(gap)序列,拼接后获得VP2全基因组序列。利用生物信息学技术分析VP2基因组,最后对VP2和相关噬菌体做DNA聚合酶(DNApol)基因的进化树分析。结果:VP2属短尾噬菌体科,基因组全长39853bp,为环状双链DNA,G+C含量为50.56%,较高于霍乱弧菌测序菌株N16961基因组G+C含量;VP2的基因组有碱基使用偏性;预测和注释了45个开放读码框(ORF),分析了DNA复制基因、衣壳蛋白和DNA包装基因、侵染相关基因。DNApol进化树比较结果,VP2与链球菌噬菌体Cp 1和芽孢杆菌噬菌体GA 1分为一群。根据对VP2基因组序列的测定和分析预测了VP2的ORF,并分析了其中的功能基因,推测VP2在进化关系上属于噬菌体phi29样噬菌体。

基因检测技术在尘肺病预防中的应用研究

本文从基因组学、分子医学、临床医学和职业安全健康管理的角度,综合近年来最新的研究成果,阐明应用基因检测技术进行尘肺病易感人群风险筛查的技术原理、可行性及具体做法,从而达到有效降低尘肺病发病率的目的。

用MTT比色法比较五种国产活性炭对饮用水中毒性物质的吸附作用

饮用水处理的一项关键工艺流程是活性炭吸附。我们采用MTT比色法 ,对五种国产活性炭吸附饮用水中毒性物质的处理效果进行了比较。结果表明 :与未经活性炭处理的 6号水样的水质相比 ,活性炭被使用 1.5a后 ,处理 1号水样所用的活性炭仍有一定的吸附作用 ;处理 5号、2号和 3号水样所用的活性炭基本上已失去了其吸附作用 ;对 4号水样所用活性炭的处理效果应进一步研究。

超敏C反应蛋白、脂蛋白(α)和脂联素集成检测诊断冠心病的价值

目的探讨超敏C反应蛋白(hs-CRP)、脂蛋白(α)[Lp(α)]和脂联素联合检测对冠心病的诊断价值。方法对161例疑诊冠心病的患者进行冠状动脉造影检查,根据造影结果分为冠心病组和非冠心病组,收集5 ml无抗凝全血标本,分离血清,利用悬浮芯片同时检测同一标本hs-CRP、Lp(α)和脂联素3个指标。结果冠心病组hs-CRP、Lp(α)测定值均显著高于非冠心病组(P<0.01),而冠心病组脂联素测定值显著低于非冠心病组(P<0.01);3个指标集成检测进行平行试验分析时灵敏度(90%)显著高于单个标志物检测的灵敏度[hs-CRP 65%、Lp(α)74%、脂联素58%,P<0.01],进行系列试验分析时特异度(92%)显著高于单个标志物检测的特异度(hs-CRP85%、Lp(α)69%、脂联素75%,P<0.01)。结论集成检测hs-CRP、Lp(α)和脂联素能更准确诊断冠心病,有效的减少漏诊与误诊。

新的生长激素异形体基因的发现及全长cDNA的克隆

在通过大规模 ESTS技术对垂体基因表达谱的研究中 ,从垂体组织产生了 72 2 2个 ESTS,有385个 ESTs是代表生长激素 (GH)基因的 ,其中 1个为中间缺失 1 38bp的 GH异形体基因 ,并经巢式 RT- PCR及测序证实 ;该基因编码 1 71个氨基酸的前肽 ,去除信号肽后 ,其成熟肽由 1 45个氨基酸组成 ;经生物信息学处理 ,其分子量大小约 1 7k D;与正常生长激素分子内有 2个 GH受体结合位点不同 ,该新的 GH异形体分子内仅有一个生长激素受体的结合位点 .研究结果揭示 :正常垂体内存在着新的 GH异形体基因 ,该基因可能编码外周血中 1 6k D的生长激素 ;其功能可能为 2 2k D GH的生理拮挤剂 .

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物。将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX-4T-1和tdhS/pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达的工程菌株。优化诱导表达条件,表达耐热直接溶血毒素。转化有重组质粒tdhA/pGEX-4T-1,tdhS/pGEX-4T-1的BL21可稳定高效地表达可溶形式的目的蛋白。表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用GST琼脂糖珠柱亲和层析纯化。溶血实验表明,表达的蛋白具有溶血活性。

用CBMN法比较五种国产活性炭对饮用水中有机提取物的吸附作用

采用三项细胞学指标 (细胞生长抑制率、双核细胞的微核率和胞质分裂增殖指数 )对 5种国产活性炭吸附饮用水中有机提取物的作用进行了比较 .结果表明 :活性炭处理后比处理前水质显著转好 ,三项指标检测 5种国产活性炭吸附细胞毒性物质的效果获得了一致性的结果 .

人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测

提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b(+),将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b(+)。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用(酪蛋白为底物),重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。

一种高效扩增血清松弛环状乙型肝炎病毒DNA全长基因组方法的研究

目的建立基于滚环复制的、高效扩增血清松弛环状乙型肝炎病毒DNA（HBV RC-DNA）全长基因组的方法。方法以60例慢性乙型肝炎患者血清HBV RC-DNA为研究对象,利用T4 DNA polymerase和T4 DNA ligase,封闭HBV RC-DNA基因组上的缺口,使之成为闭合环状结构;再通过Phi29 DNA polymerase的作用,对闭合环状的HBV基因组进行滚环复制,以滚环复制后的RC-DNA为模板扩增HBV全长基因组。结果成功建立了基于滚环复制的HBV RC-DNA全长基因组扩增方法,可从病毒载量为108~104拷贝/ml样本中扩增出HBV全长基因组。对于107~105拷贝/ml血清样本来说,使用基于RC-DNA滚环复制的全长基因组扩增方法,与以往的一步法扩增相比,扩增效率显著提高。结论基于滚环复制的HBV RC-DNA全长基因组扩增方法具有较高的灵敏度。该方法的建立为HBV全基因组研究提供了一种新的、有效的工具,有望在基础和临床研究中广泛应用。

霍乱弧菌分型噬菌体VP3基因组序列的测定与分析

测定和分析霍乱弧菌分型噬菌体VP3基因组序列,并为ElTor型霍乱弧菌两类菌株的分型方法原理提供研究基础。鸟枪法构建VP3噬菌体全基因组随机文库;测序拼接成最小重叠群,引物步移法填补缝隙序列,拼接后获得VP3全基因组序列。PCR随机扩增噬菌体DNA片段并酶切鉴定;预测可能存在的开放读码框(ORF);对VP3和相关噬菌体的DNA聚合酶基因作进化树分析,协助判定VP3的分类;对预测的部分启动子区利用报道基因进行活性分析。VP3全基因组为环状双链DNA,长度39504bp;酶切鉴定结果与序列一致。确定了49个ORF,注释了27个ORF的编码产物,其中有20个基因产物与T7样噬菌体同源,包括RNA聚合酶(RNAP)、参与DNA复制的蛋白、衣壳蛋白、尾管及尾丝蛋白、DNA包装蛋白等。DNA聚合酶(DNAP)进化树分析表明VP3与T7样噬菌体有同源性。将预测的10个启动子序列克隆到lacZ融合质粒pRS1274上,经检测均具有启动子活性。测定和分析VP3的基因组序列,基因组结构与进化树分析提示VP3属于T7噬菌体家族。

饮用水加氯消毒副产物(三卤甲烷和卤乙酸)研究

本研究在国内首次建立了饮用水中卤乙酸的测定方法,通过对国内某水厂出厂水以及水处理流程中卤乙酸和三卤甲烷的分析测定,得知如下初步结论:该水厂出厂水中卤乙酸和三卤甲烷含量均较低,出厂水质较好;影响消毒副产物量的主要因素有:加氯消毒方式、pH值和预加氯量;活性炭对卤乙酸的吸附效果要优于对三卤甲烷的吸附。

五种国产活性炭吸附饮用水中有机污染物的比较

采用细胞生长抑制率、用MTT比色法测量细胞的增殖毒性和用流式细胞光度计测量细胞的凋亡率三项细胞毒性指标 ,评价了 5种国产活性炭处理饮用水 3a后的使用效果。实验表明 4号活性炭仍具有一定的吸附功能 ,其他 4种活性炭已经失去吸附过滤作用。此外还对

抗H5N1禽流感病毒VHH抗体库的构建

目的:构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链可变区抗体库(VHH型抗体库),为抗H5N1的VHH抗体筛选奠定基础。方法:利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼,一定免疫时间后测定小羊驼外周血清中抗体中和活性,分离其外周淋巴细胞,利用RT-PCR方法得到VHH抗体片段。通过优化连接和电转化方法,将足量VHH片段与pCANTAB5E连接后电转入大肠杆菌TG1,获得VHH抗体基因库;检测基因库库容以及多样性,并采用血凝抑制试验对噬菌体抗体库进行初步功能性鉴定。结果:利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼四次后,其外周血清中抗体血清抑制效价可达1∶2 560,构建的VHH抗体基因库库容可达3×108,随机挑选14个抗体基因克隆进行测序鉴定,结果显示均为独立克隆,表明所建抗体库多样性好。上述基因库经辅助噬菌体拯救后,得到抗H5N1的噬菌体VHH型抗体初级库,对初级库进行血凝抑制试验,结果呈阳性,表明初级库中存在具有潜在中和活性的抗H5N1抗体。结论:结果表明,已成功构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链抗体库,为进一步筛选抗H5N1禽流感的重链抗体打下良好基础,并为H5N1的早期临床诊断和治疗提供新的手段。