米曲霉基因工程技术的进展

丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)是发酵工业的重要菌株,具有强大的蛋白分泌能力和公认的食品安全性,可作为表达外源蛋白的细胞工厂。然而利用米曲霉分泌生产外源蛋白质常会受限于一些瓶颈问题:包括转录、翻译、蛋白质折叠、易位、降解、运输和分泌等。这些问题的存在导致米曲霉外源蛋白生产很难达到预期的效果。近年来,随着全基因组序列的破译,米曲霉生产相关基础研究以及基因工程技术都得到了较好的发展。如提高同源重组效率、选择性标记基因应用技术、染色体大片段删除技术、菌丝融合技术和DNA芯片技术等。这些技术的开发和建立为米曲霉工业生产应用提供了大量技术支持。针对米曲霉在外源表达蛋白中存在的瓶颈问题,主要通过以下几个方面进行了阐述:转化系统的优化和转化效率的提高、蛋白酶基因缺陷菌株的构建、融合表达策略,以及优化其外源表达系统来提高外源蛋白生产等。这些米曲霉生产相关基础研究以及基因工程技术的进步很大程度上提高了米曲霉的生产应用,并为今后米曲霉生产菌株的育种提供了更多有效的途径和研究空间。

高效纤维素降解菌Flavodon sp.x10的酶学活性

为了筛选高效纤维素降解真菌,本研究利用采集的江苏省盐城东台杨树人工林土壤凋落物作为分离样品,通过在纤维素为碳源的选择培养基上进行培养、结合刚果红染色筛选出透明圈较大的纤维素降解菌株。通过对筛选的菌株酶活测定和比较,发现了一株高效纤维素降解真菌。根据菌株形态和ITS序列分析将其鉴定为黄囊孔菌Flavodon的一个种,命名为Flavodon sp.x10。该菌株菌丝呈白色,无孢子产生,能利用自然界中的大部分碳源,适应能力较强。纤维素相关酶活测定结果表明Flavodon sp.x10的滤纸酶活为0.1388 U/mL,内切型-β-葡聚糖酶活为0.3592 U/mL,微晶纤维素酶活为0.1358 U/mL,β-葡萄糖苷酶活为0.1221 U/mL。在基础培养基中加入20.0 g/L葡萄糖,5.0 g/L蛋白胨,0.01 g/L维生素B1,1.0 g/L磷酸二氢钾,0.5 g/L七水硫酸镁,0.2 g/L碳酸钙,0.3 g/L七水硫酸锌,能够较大提高菌株产酶能力。根据酶活数据分析,纤维素降解过程中微晶纤维素酶起主导作用,β-葡萄糖苷酶起次要作用,内切型-β-葡聚糖酶对于纤维素降解作用最低。Flavodon sp.x10可作为潜在的开发菌种用于纤维素生物降解的研究。

曲霉属bHLH转录因子的研究进展

bHLH(Basichelix-loop-helix)转录因子广泛存在于真核生物中,它可以通过同源或异源二聚体的形式与基因启动子上的E-box结合来调控基因的表达。转录因子的bHLH家族由广泛涉及发育过程(包括细胞增殖和分化)的大量蛋白组成,在生物的生长发育调控过程中起着极为重要的作用。本文对包括构巢曲霉、烟曲霉、米曲霉等曲霉属中现已发现bHLH转录因子的调控过程和生物功能进行概述,以期为深入研究曲霉属的生长发育及bHLH转录因子的功能提供理论参考。

应用双分子荧光互补技术分析米曲霉Fus3与Ste12之间的蛋白互作

【背景】双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)在水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)等微生物蛋白互作中的应用已有报道,但在工业菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)中还未见应用。【目的】探究米曲霉中Fus3和Ste12蛋白在生长发育中可能存在的相互作用关系,建立在米曲霉活细胞中检测蛋白互作的方法,即BiFC体系。该系统可用于特异性、可视化米曲霉目标蛋白在活细胞中的定位,并且可以更加直观地探究蛋白之间是否存在相互作用。【方法】利用MultisiteGateway复杂载体构建技术,使用切开的绿色荧光蛋白,将荧光蛋白分子的两个片段N端和C端分别与米曲霉Fus3和Ste12蛋白融合,对获得的转化株进行荧光观察。通过BiFC系统检测蛋白之间的相互作用。【结果】成功转化的米曲霉菌丝中观察到荧光,Fus3和Ste12在米曲霉中存在相互作用。【结论】通过BiFC技术证实蛋白质Fus3和Ste12在无性繁殖菌株米曲霉体内发生互作,暗示它们通过互作可能参与除了有性生殖之外的其他细胞功能,并为米曲霉蛋白互作功能研究提供一种新的检测技术和方法。