不同强度超声破坏微泡对犬心肌组织的生物学效应

目的探讨不同强度的超声破坏微泡对犬心肌组织的生物学效应,优化出影响心肌微环境的最佳辐照条件。方法9只健康成年杂种犬随机分成3组,每组3只。静脉输入2ml微泡造影剂,同时采用频率为1MHz,强度不同的超声辐照(0.5W/cm2、1.0W/cm2、2.0W/cm2)犬心肌组织,辐照时间为5min。辐照完毕后即刻处死动物,取局部心肌组织。进行病理组织HE染色和透射电镜观察犬心肌细胞及毛细血管内皮细胞等细胞超微结构改变。结果0.5W/cm2超声破坏微泡后心肌组织水肿,无出血;1.0W/cm2超声破坏微泡后心肌组织轻微出血和少量炎症细胞浸润;2.0W/cm2超声破坏微泡后心肌组织明显出血,炎症细胞一定程度浸润。结论不同强度超声破坏微泡造影剂能使犬心肌组织产生不同程度的生物学效应;超声强度在1.0～2.0W/cm2能在使心肌轻度损伤时引起一定程度的炎症反应。

犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定方法

探讨一种可靠、纯度高的犬骨髓间充质干细胞(BMMSCs)体外提取分离、纯化、培养和鉴定的方法。采用骨髓穿刺、Percoll密度梯度离心法分离出犬骨髓单个核细胞,结合贴壁培养法获得纯度高的犬BMMSCs,应用细胞免疫化学和流式细胞仪对犬BMMSCs表面标记蛋白进行细胞鉴定和周期测定。结果显示分离的细胞CD29、CD44均呈阳性表达,CD31、CD34、CD45和vWF的表达为阴性;88.88%的细胞处在G0/G1期;由此证明所分离的细胞为犬BMMSCs,2周内经3代培养即可扩增到107细胞数量级,纯度可达到99%以上,为干细胞移植治疗缺血性心脏病提供充足的细胞来源。

青钱柳愈伤组织总黄酮碱溶酸沉提取工艺

目的:研究以碱溶酸沉法提取青钱柳愈伤组织中的总黄酮。方法:采用碱溶酸沉法,对影响青钱柳愈伤组织中总黄酮提取的pH值、固液比、提取时间、硼砂用量等因素进行系统研究。结果:青钱柳愈伤组织中总黄酮碱提酸沉的最佳提取工艺为:采用固液比1:20,碱提液pH9,硼砂含量2.5%,提取时间60min,酸沉pH4.5。结论:在最佳提取工艺下,青钱柳愈伤组织中总黄酮得率达到4.01%。

低频超声辐照微泡造影剂增强米托蒽醌对乳腺癌细胞的毒性作用

目的观察超声辐照微泡造影剂对米托蒽醌杀伤人乳腺癌细胞MCF-7作用的影响,并探讨其作用机制。方法以MTT法检测米托蒽醌对MCF-7细胞的细胞毒作用,计算其24 h的IC50值。将对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7分为单纯米托蒽醌组(D组)、超声+米托蒽醌组(U+D组)、超声+微泡+米托蒽醌组(U+M+D组)、空白对照组(C组)。以MTT法检测各组细胞活性,高效液相色谱法测定用药各组细胞内米托蒽醌的含量,采用透射电镜观察MCF-7细胞形态学特征。结果米托蒽醌对MCF-7细胞的IC50值为2.87μg/ml。各组细胞经处理后培养24 h,细胞活性率C组>D组>U+D组>U+M+D组,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。高效液相色谱法测定用药各组细胞内米托蒽醌的含量为U+M+D组>U+D组>D组,差异有统计学意义(P<0.05)。透射电镜可观察到MCF-7细胞凋亡的典型形态学改变。结论低频超声辐照可促进化疗药物进入肿瘤细胞内,增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用,而低频超声辐照微泡可进一步增强该效应。

超声微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导EPCs归巢大鼠缺血心肌

目的观察超声破坏微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导EPCs移植归巢大鼠缺血心肌的可行性及有效性。方法采用Percoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓人脐血单个核细胞(MNCs),血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)诱导培养;Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293细胞中进行扩增,之后感染体外培养的内皮祖细胞(EPCs)。将30只SD大鼠建立MI模型后随机分为5组:①空白对照组(C),②超声+微泡组(US+MB),③单纯EPCs组(EPCs),④超声+EPCs组(US+EPCs),⑤超声+微泡+EPCs组(US+MB+EPCs)。EPCs移植后48h处死大鼠,以激光共聚焦显微镜观察大鼠心肌组织内EPCs的分布,Westernblot检测HIF-1α的表达。结果 US+MB+EPCs组绿色荧光强度高于其他各组,Westernblot显示,US+MB+EPCs组HIF-1α蛋白表达高于其他组(P<0.05)。结论超声破坏微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导EPCs移植可有效促进EPCs归巢,为干细胞移植治疗IHD提供了一种新的途径。

比较脂质微泡与聚合物超声造影剂的微循环流变学

目的探讨脂质微泡与高分子聚合物超声造影剂在大鼠肠系膜微循环中的流变学特征。方法对10只大鼠经股静脉分别注射DiI标记的脂质微泡和高分子聚合物超声造影剂,通过倒置荧光显微镜观察两种不同造影剂在大鼠肠系膜微循环中的运动情况;比较注射前后小动脉、小静脉及毛细血管内径的变化,测定红细胞与两种造影剂在微循环内的流速。结果注射后两种造影剂在大鼠肠系膜微循环内均可随血流移动,仅见少量脂质微泡短暂滞留。注射造影剂前后小动脉、小静脉及毛细血管内径无明显改变(P>0.05);两种造影剂在微循环内的流速与红细胞相似,差异无统计学意义(P>0.05)。结论脂质微泡和高分子聚合物超声造影剂具有与红细胞相似的微循环流变学特征,均可作为红细胞示踪剂。

超声微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导EPCs移植治疗大鼠心肌梗死

目的探讨超声微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导内皮祖细胞(EPCs)移植治疗大鼠心肌梗死的可行性。方法将Ad-EGFP/HIF-1α转染EPCs。将30只SD大鼠建立心肌梗死模型后随机分为5组:空白对照组(C组)、超声+微泡组(US+MB组)、单纯EPCs组、超声+EPCs组(US+EPCs组)及超声+微泡+EPCs组(US+MB+EPCs组)。EPCs移植后4周,用超声心动图检测大鼠左心室收缩功能,免疫组织化学(I HC)染色法检测CD34的表达及微血管密度(MVD),Western blot检测VEGF蛋白的表达。结果 US+MB+EPCs组射血分数、短轴缩短率高于其他各组(P<0.05),MVD计数高于其他各组(P<0.05)且VEGF蛋白表达水平最高(P<0.05)。结论超声微泡联合Ad-EGFP/HIF-1α介导EPCs移植可通过促进VEGF的高效表达、刺激心肌梗死周边区血管生成等途径改善心肌梗死大鼠的心功能。

载10-羟基喜树碱靶向脂质微泡的制备及体外寻靶能力实验研究

目的制备携人肝癌单抗Hab18载10-羟基喜树碱的脂质微泡,并观察其体外寻靶能力。方法制备生物素化抗人肝癌Hab18单克隆抗体,检测其生物素化程度;用机械振荡法制备载药脂质微泡,以生物素-亲和素桥连方式构建携人肝癌单抗Hab18载10-羟基喜树碱的脂质超声微泡,检测其一般特性、包封率和载药量,以免疫荧光法检测微泡与抗体的连接情况,在光镜下观察靶向载药微泡的寻靶能力,并与载药非靶向微泡进行比较。结果每个单抗分子平均可与13个生物素分子结合。载药靶向脂质超声微泡分布均匀,平均粒径为1.52μm,包封率为76.32%,载药量为21.81%。免疫荧光法显示微泡表面可见明亮的红色环状荧光,体外寻靶实验显示该载药靶向微泡可与人肝癌7721细胞牢固结合。结论携人肝癌单抗Hab18载10-羟基喜树碱的脂质超声载药靶向微泡可成功制备,其包封率和载药量较高,具有较强的体外寻靶能力。

重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α转染大鼠内皮祖细胞

目的:研究含缺氧诱导因子(HIF-1α)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组腺病毒(Ad-EGFP/HIF-1α)感染大鼠内皮祖细胞(EPCs)的可行性.方法:采用percoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓单个核细胞,VEGF,bFGF,EGF诱导培养,观察其形态学变化,免疫细胞化学染色鉴定其表面抗原.Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293细胞中进行扩增,之后转染体外培养的EPCs,分别于24,48,72,96h采用倒置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)情况.MTT检测细胞生长活性;流式细胞术检测转染率并用RT-PCR法测定HIF-1α在EPCs中的表达.结果:倒置荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,随着时间的延长,绿色荧光逐渐增多.MTT法检测细胞在24,48,72,96h的存活率分别为99.83%,99.70%,99.32%,99.57%;流式细胞仪计数随时间的延长,转染率逐渐升高,24,48,72,96h的转染率分别为23.05%,45.94%,78.91%,85.64%.RT-PCR可检测到被感染细胞HIF-1α的表达.结论:重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α能够有效地感染EPCs,转染后在mRNA水平可检测到EPCs中有HIF-1α的表达,并对EPCs活性无明显影响,为进一步研究转基因的EPCs移植促血管新生奠定基础.

携紫杉醇和Herceptin高分子超声造影剂体外寻靶及体内肿瘤药物含量分析

目的探讨携紫杉醇和Herceptin高分子造影剂(Pac-PLGA-HER)的体外寻靶能力及体内肿瘤药物含量。方法通过双乳化法及碳二亚胺法制备Pac-PLGA-HER,观察其与乳腺癌细胞MCF-7的结合能力。将25只种植有乳腺癌细胞MCF-7的裸鼠分为单纯紫杉醇(PTX)组、单纯载药微球(Pac-PLGA)组、单纯载药微球+超声(Pac-PLGA+US)组、靶向载药微球(Pac-PLGA-HER)组及靶向载药微球+超声(Pac-PLGA-HER+US)组,根据微球载药量调整到相应药物浓度,经尾静脉注入裸鼠体内,观察各组在荷瘤裸鼠肿瘤内药物含量情况。结果Pac-PLGA-HER平均粒径为(777.40±65.90)nm,包封率为(65.84±2.25)%,载药量为(6.58±0.23)%,体外寻靶实验可观察到Pac-PLGA-HER与乳腺癌细胞MCF-7大量结合。体内药物释放实验显示Pac-PLGA-HER+US组在裸鼠肿瘤内药物浓度高于其他各组(P<0.01)。结论 Pac-PLGA-HER与乳腺癌细胞MCF-7有较好的结合能力,体内药物释放实验中Pac-PLGA-HER+US组在裸鼠肿瘤内有较高的药物浓度。

近红外荧光分子探针用于CT成像及术中导航

目的制备近红外荧光分子探针,观察其用于增强CT成像及术中导航效果。方法采用薄膜水化法制备载IR780和全氟溴辛烷(PFOB)的脂质体(IR780@LIP-PFOB),检测其基本理化性质,观察其用于增强体内、外CT成像的效果。以激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察4T1细胞对IR780@LIP-PFOB的摄取情况,以活体荧光成像检测IR780@LIP-PFOB在荷4T1瘤BALB/c小鼠体内的分布,通过冰冻切片观察IR780@LIP-PFOB在肿瘤区和周围非瘤组织的分布;以实时体视荧光成像系统评估IR780@LIP-PFOB用于术中导航的效能。结果所获IR780@LIP-PFOB大小均匀,呈球形,平均粒径(262.80±117.60)nm,表面电位(-20.10±6.38)mV,IR780包封率为82.92%;用于小鼠体内、外CT可显著增强成像效果。IR780@LIP-PFOB可选择性聚集于4T1细胞周围并于肿瘤区富集,而非瘤组织中未见其明显聚集;用于术中导航可清晰辨识肿瘤组织及其边界。结论成功制备的近红外荧光分子探针用于小鼠能增强CT成像效果,并支持术中导航。

超声造影和剪切波弹性成像评估颈动脉斑块及其与急性冠状动脉综合征的关系

目的应用超声造影联合剪切波弹性成像技术评估颈动脉斑块,探讨颈动脉斑块性质与非ST抬高型急性冠状动脉综合征(ACS)的关系。方法选取我院冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)患者88例,分为非ST抬高型ACS 45例(ACS组)和稳定性冠心病43例(SCHD组)。均行颈动脉常规超声检查是否存在颈动脉斑块,剪切波弹性成像及超声造影评估颈动脉斑块的弹性及造影强度,比较两组上述参数的差异。采用Logistic回归分析ACS发生的独立危险因素。结果常规超声显示ACS组中低回声斑块检出率和混合回声斑块检出率均高于SCHD组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。超声造影显示ACS组斑块最大增强强度和最大增强密度均较SCHD组增高,达峰时间较SCHD组缩短,差异均有统计学意义(均P<0.05)。剪切波弹性成像显示ACS组斑块平均杨氏模量值明显低于SCHD组,差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析显示,颈动脉斑块最大增强密度是ACS发生的独立危险因素(OR=2.853,95%可信区间0.161~7.091,P=0.027)。结论超声造影和剪切波弹性成像技术均能定量分析颈动脉斑块的稳定性与易损性,为预测冠状动脉病变的发生提供参考依据。

二维斑点追踪成像技术评价曲美他嗪治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病伴心力衰竭左室局部收缩功能

目的应用二维斑点追踪成像技术评价曲美他嗪治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)合并心力衰竭后左室局部收缩功能改变。方法选取冠心病患者48例(左室射血分数均<50%),随机分为治疗组24例和对照组24例,两组均给予冠心病常规治疗,治疗组加用标准剂量的曲美他嗪治疗6个月。应用二维斑点追踪成像技术测量并比较两组治疗前后左室前间隔和前壁的基底段、中间段及心尖段的纵向、径向及圆周应变收缩期峰值。结果治疗组和对照组治疗后各节段纵向、径向及圆周应变收缩期峰值均呈不同程度升高,与治疗前比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。治疗组治疗后纵向、径向及圆周应变收缩期峰值均较对照组治疗后明显提高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论应用二维斑点追踪成像技术可对左室射血分数下降的冠心病患者接受曲美他嗪治疗后的左室局部收缩功能进行评估,具有一定的临床价值。

Tei指数评价曲美他嗪治疗糖尿病心肌病慢性心力衰竭的临床研究

目的探讨Tei指数评价曲美他嗪治疗对老年糖尿病心肌病(DCM)慢性心力衰竭患者心功能的影响。方法选取DCM慢性充血性心力衰竭患者47例,随机分为对照组23例和治疗组24例。对照组给予标准药物治疗,治疗组在标准药物治疗基础上给予曲美他嗪治疗。观察两组治疗前和治疗后6个月的Tei指数及脑利钠肽(BNP)的变化。结果两组治疗后BNP降低,Tei指数减小,治疗组较对照组改善更明显,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 Tei指数能够评价曲美他嗪治疗对老年DCM慢性心力衰竭患者心功能的改善,有一定临床价值;BNP可作为诊断老年DCM患者心力衰竭的重要指标。

超声微泡造影剂在血管新生中的应用研究进展

随着对超声微泡造影剂研究的不断深入，人们发现超声微泡造影剂在一定强度的超声辐照后会产生一系列的生物学效应：可使细胞膜通透性增加，毛细血管内皮间隙增宽；局部组织微血管破裂，刺激内源性血管生长因子分泌，引起局部组织内微环境改变，促进血管新生与重构。本文就超声微泡造影剂在血管新生中的应用作一简要综述。

携Herceptin靶向高分子造影剂的制备及体外寻靶能力研究

目的 制备一种携Herceptin的靶向高分子造影剂,并研究其体外寻靶能力.方法 通过双乳化法制备出高分子PLGA-COOH造影剂,采用碳二亚胺法将高分子PLGA-COOH造影剂与Herceptin相连制备出靶向高分子造影剂,检测其一般性质,然后通过免疫荧光法检测其与抗体的连接情况,用光镜及激光共聚焦显微镜观察其与细胞的结合能力,并与普通高分子造影剂做比较.结果 靶向高分子造影剂的粒径范围为466.8～857.6 nm,平均粒径为（662.2±69.7）nm,有85.9%的微球粒径落于该范围内,通过免疫荧光法可在荧光显微镜下观察到许多绿色点状荧光,体外寻靶能力实验显示靶向高分子造影剂能与乳腺癌细胞较好的结合.结论 成功制备出的携Herceptin的靶向高分子造影剂在体外与人乳腺癌细胞有较好的结合能力.

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

目的研究大鼠骨髓来源的内皮祖细胞（EPC）的分离、鉴定、培养方法以及向内皮细胞分化的诱导条件。方法密度梯度离心法分离SD大鼠股骨及胫骨单个核细胞，经差速贴壁后取2次贴壁细胞置于纤连蛋白铺被的培养板中。在血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及表皮生长因子（EGF）诱导下培养两周，观察其形态学改变，以免疫细胞化学染色及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法对其进行鉴定。结果贴壁细胞呈现铺路石、团簇样生长，呈梭形、线样排列特殊形态。免疫细胞化学结果显示，贴壁细胞CD133、CD34、Flk-1、血管性假血友病因子（vWF）在不同时段呈阳性表达。诱导培养第2天，CD133阳性表达率为（79．4±4．5）％。自诱导培养的第6天开始，Flk-1与vWF呈高表达，阳性率为（74．2±3．5）％和（72．2±4．3）％。结论用Percoll密度梯度离心法在VEGF、bFGF及EGF培养体系下可以获得较高纯度的EPC，该细胞具有内皮细胞的特性，经过体外诱导可以分化为内皮细胞。

超声击破微泡对重组腺病毒Ad-EGFP／HIF-1α活性的影响

目的探讨超声破坏载重组腺病毒Ad—EGFP／HIF-1α的微泡对AdEGFP／HIF-1α生物学活性的影响。方法采用机械振荡法及分层吸附法制备携带重组腺病毒的脂质超声微泡造影剂，用DFY-Ⅱ型超声图像定量分析诊断仪检测微泡粒径，计算其浓度。将脐静脉内皮细胞（HUVEC）接种在24孔板中，随机分为以下5组：①空白对照组；②重组腺病毒Ad—EGFP／HIF-1α组；③载重组腺病毒Ad—EGFP／HIF-1α微泡组；④超声＋重组腺病毒AdEGFP／HIF-1α组；⑤超声＋载重组腺病毒AdEGFP／HIF-1α微泡组。荧光显微镜及流式细胞仪检测各组在细胞内的表达及转染效率，RTPCR法检测HIF-1α的mRNA的表达。结果载重组腺病毒的超声微泡的大小、粒径及分布与普通超声微泡相似。与对照组相比，各组间绿色荧光强度及转染率无明显差别；各组间HIF-1αmRNA的表达也无明显差别。结论利用超声破坏载重组腺病毒AdEGFP／HIF-1α的微泡造影剂对腺病毒活性无明显影响，为拓展超声微泡介导的基因治疗领域提供了新的思路和方法。

超声靶向破碎微泡对心肌梗死犬心肌微环境的影响

为了研究超声靶向破碎微泡对犬心肌梗死模型局部心肌微环境的影响。将10只犬随机分为实验组与对照组,每组5只犬,结扎犬左前降支,建立心肌梗死模型。建立心肌梗死模型后1周,将实验组每只模型犬用脉冲超声(强度为1.0 W/cm2,频率为1 MHz)经胸辐照心肌,辐照时间共为10 min,同时静脉注入2 m L超声微泡。按照上述方法,每隔2 d处理一次,一共处理3次。对照组中的模型犬不经预处理。在所有犬心肌梗死模型建立后两周左右处死所有实验犬,取出心脏,于心肌梗死周边区域选取相应心肌组织,并送检。所取组织均采用免疫组织化学染色法、Western blotting法及定量实时PCR法分别从蛋白以及基因水平测量局部心肌组织内VCAM-1、VEGF、SDF-1和IL-1β的含量,从而探讨超声靶向辐照破碎微泡对犬心肌梗死模型局部心肌微环境的影响。免疫组织化学染色法及Western blotting法从蛋白水平定性和半定量观察到实验组中梗死周边区心肌分泌的VCAM-1、VEGF、SDF-1和IL-1β量明显多于对照组心肌梗死周边区;定量实时PCR法从基因水平定量分析检测显示实验组内梗死周边区心肌分泌VCAM-1、VEGF、SDF-1和IL-1β明显高于对照组中心肌梗死周边区(p<0.05)。采用一定量的超声被动靶向辐照破碎微泡能够引发心肌内源性生物活性物质的分泌,促进VCAM-1、VEGF、SDF-1和IL-1β的高表达,从而使局部心肌微环境得到一定改变,有利于干细胞移植治疗缺血性心脏病。