基于鸡毒支原体黏附素蛋白的表位疫苗制备及免疫效果评价

旨在使用鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的黏附蛋白设计一种更安全、有效的多表位候选疫苗。本研究运用生物信息学方法对鸡毒支原体的多个黏附素蛋白(CrmA、GapA、Mgc2、PvpA)的B、T细胞表位进行预测。将筛选的抗原表位合成新的表位基因肽段(命名为mEA)。通过生物学在线软件分析了mEA的二级结构、亲水性、抗原性、三级结构。构建重组质粒pET32a-MG-mEA,经限制性内切酶(BamHⅠ和HindⅢ)酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化。Western blot验证重组蛋白与鸡MG阴性/阳性血清的反应性。纯化的MG-mEA重组蛋白与佐剂1∶1混匀,制备为多表位疫苗,通过SPF鸡免疫试验分析融合蛋白免疫原性。结果显示,mEA序列二级结构较稳定,抗原性良好。重组质粒经PCR扩增获得1680 bp大小的目的条带,与预计相符。SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约48 ku,主要以可溶性形式存在。Western blot试验证明该蛋白反应原性良好。多表位疫苗免疫SPF鸡,经ELISA检测显示:二免后10 d各免疫组抗体水平达到最高,3个重组蛋白免疫组与PBS组相比差异均具有显著统计学意义(P<0.05)。攻菌结果表明,MG感染明显损伤了气管黏膜结构,而重组蛋白+佐剂制备的疫苗能够有效保护MG的损伤。综上,本研究结果为研制安全有效的候选MG疫苗提供了新的途径。

鸡毒支原体MG-HY株感染鸡气管的转录组学分析

旨在进一步探究鸡毒支原体(MG)感染SPF雏鸡后气管基因组转录水平的变化,筛选出MG感染后参与气管黏膜炎性损伤的差异表达基因和调控通路。使用MG-HY株菌液按0.2 mL·羽经点眼滴鼻感染SPF雏鸡,感染后收集气管组织利用RNA-Seq技术进行测序分析。转录组分析结果显示,在MG感染期间RNA-seq共筛选出3 112个显著(P<0.01)差异表达基因(DEGs),其中,1 646个上调基因,1 466个下调基因。GO功能分析显示,差异基因主要涉及生物调节、刺激的反应、多细胞生物过程、细胞成分组织或生物发生等生物过程。KEGG-Pathway分析发现差异基因参与黏膜免疫信号传导通路,例如:细胞因子-细胞因子受体相互作用,细胞黏附分子(CAMs),细胞外基质(ECM)受体相互作用、紧密连接、PPAR信号通路和MAPK信号通路等,表明这些基因参与了MG诱导的雏鸡气管炎症反应和损伤。使用qRT-PCR验证与黏膜免疫相关的13个差异表达的基因,其结果与转录组分析一致。本研究为进一步阐明MG感染导致宿主气管黏膜上皮损伤和黏膜免疫机制提供了基础。