禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为了对致病性强、危害性大的H5、H7、H9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了H5、H7、H9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针。将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒H5、H7、H9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象。同时敏感性高,检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的敏感性分别达到1 0001、000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感H5、H7、H9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型。所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、HA、HI)的符合率达100%。用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%。

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏性试验

为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度,通过测定已知鸡胚半数致死量(ELD50)的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚,对深圳出入境检验检疫局保存的H5和H9亚型标准禽流感毒株进行了鸡胚半数致死量(ELD50)的测定,结果为H5亚型禽流感毒株的半数致死量为10-7.75/0.2mL,H9亚型禽流感毒株的半数致死量为10-8.5/0.2mL。用所研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型标准禽流感毒株原液进行10倍连续稀释,进行实时荧光RT-PCR灵敏度的测定,结果发现:试剂盒检测H5亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10-5倍稀释液,该稀释液含有281ELD50病毒量;检测H9亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10-8倍稀释液,该稀释液含有15.8ELD50病毒量。同时检测H5和H9时,试剂盒的灵敏度要比单独检测一个亚型时的灵敏度增加一个数量级。本灵敏度已经能够检测到感染鸡的喉拭子和(或)泄殖腔拭子所采集的病毒量,能够满足检验检疫的实际需要。

用基因芯片鉴别诊断四种水泡性疾病

为了对临床上症状非常相似的四种水泡性动物疾病进行大批量、快速准确的检测,我们尝试用基因芯片技术来对这四种水泡性疾病进行快速鉴别诊断。用Qiaquick 96 plate Kit对扩增的39个基因目的片段进行纯化,TE调配浓度至0.36礸/礚,于GMS417点样仪上按预选设计好的布阵方式点样,然后经紫外灯照射进行紫外交联等一系列处理。用Salmon进行非特异性杂交检测芯片点样的质量。大量抽提组织中FMDV和细胞上清液中的SVDV的总RNA,随机引物反转录的同时采用随机荧光标记法,标记FMDV和SVDV。标记好的cDNA超声波随机打断后进行特异性杂交,以最佳光扫描强度进行扫描,Imagene软件扫描结果,对两者信号进行对比,结合各病毒相对应的坐标,可鉴别诊断出四种动物的水泡性疾病病毒。本方法不但快速、灵敏、准确性高,而且可实现对大批量货物的集成化检测,满足我国快速通关的要求。

H5N1亚型禽流感疫苗对供港鸡免疫效果评价

针对供港活鸡饲养周期长（85日龄～105日龄），禽流感抗体滴度要求高（21／28检测样品抗体滴度需≥4log2）的特点，在原有H5N2疫苗对供港活禽免疫效果不理想的情况下，对哈尔滨兽医研究所研制的H5N1亚型禽流感疫苗进行了免疫效果评估。结果显示，H5N1疫苗免疫效果明显高于原有的H5N2疫苗，初步推荐该禽流感灭活疫苗对供港鸡场的免疫程序为：首免7日龄～10日龄，0．3mL／只，皮下注射；二免45日龄，0．5mL／只，肌肉注射。

鸭淀粉样变性的病理学研究——Ⅰ E.Coli及其内毒素在鸭淀粉样变性发生上的作用

在用常见致病性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌的菌体抽提物人工复制鸭淀粉样变性的基础上,采用大肠杆菌的粗制内毒素、大肠杆菌的菌体抽提物经静脉反复处理试验作发病对比试验,各组的诱发率分别是Ⅰ组50%(25/50)、Ⅱ组61.67%(37/60)、Ⅲ组53.33%(32/60)和Ⅳ组63.33%(38/60)。试验结果表明,细菌及其内毒素皆能成功地诱发本病,但菌体抽提物及不同剂量的内毒素的诱发率没有明显差异(P>0.05),胸腺的早期切除亦似乎对病的发生没有明显的影响。

胸腺在鸭淀粉样变性病中的作用探讨

1953年以来,Rigdon、Raklhmanov、Dougherty、Cowan、Malkinson、凌育燊等先后对自发性鸭淀粉样变性进行了研究。Rigdon、Thomson、凌育燊等分别用炭疽杆菌石蜡油疫苗、甲基胆蒽、浓缩烟、聚氧烯山犁醇脂肪酸脂80、矿物油以及大肠杆菌抽提物等诱导了鸭淀粉样变性。虽然,一些学者根据人的淀粉样变性常继发于长期慢性化脓性和广泛组织崩解、慢性传染病、肿瘤等疾病,以及用抗原物质能诱导哺乳动物的淀粉样变性的事实,提出了有关淀粉样变性机理假说,即淀粉样变性是免疫内环境稳定性失调的结果。但最近却有学者认为,把主要作用归咎于免疫反应是不能令人信服的,提出淀粉样变性的被诱导决定于炎症反应中的某种因子。

ELISA检测鸭病毒性肝炎抗体的研究

本文报道用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测鸭病毒性肝炎(DVH)抗体,并与琼脂免疫扩散试验(AGDP)进行了比较。ELISA的特异性与AGDP相一致;而在敏感性方面,ELISA的检出率为100％,而AGDP为60％。在ELISA抗体效价判定上,本文采用阳/阴血清OD值(P/N)≥2.1及阳性血清OD值不得小于0.4的综合阳性判定标准,减少了假阳性反应。研究表明,DVH抗体的ELISA检测法是一种快速、敏感,简便实用而准确的检测方法。

新城疫病毒cDNA文库的构建研究

本文报道了用人工合成的28聚寡核苷酸为“引物”,以强毒株新城疫 病毒(NDV)基因组PNA为模板,在逆转录酶作用下成功地合成了NDV- cDNA。后者经琼脂糖凝胶电泳观察,其大小约为0.5～14kb。从凝胶上收集 大于1.0kb以上的cDNA,用Hpa Ⅰ对其进行限制性酶切,然后将酶切片段克隆到pBR322的ScaI位点上,得到的克隆产物即为构建的NDV-cDNA文库。经用少量文库转化E.Coli HB101,得到氨苄青霉素敏感而四环素抗性的转化菌落(Amp基因因外源DNA的插入而失活)。从随机挑出的5个转化菌株中提取重组质粒,经琼脂糖凝胶电泳检测,其插入片段的大小分别为0.8～3.0kb不等。说明所构建的NDV-cDNA文库有效。

应用生物素标记的NDV－cDNA探针检测感染尿囊液中NDV－RNA的初步研究

本文应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从构建的新城疫病毒（ＮＤＶ）ｃＤＮＡ文库中扩增含编码Ｆ糖蛋白前体──Ｆｏ酶切位点序列的３５９ｂｐ的Ｆ蛋白基因ｃＤＮＡ片段。将此３５９ｂｐｃＤＮＡ片段经光敏生物素标记后,即成ＮＤＶ－ｃＤＮＡ探针。该探针能特异性地从感染的尿囊液中检测出ＮＤＶ强毒株和疫苗毒株的基因组ＲＮＡ,而不与ＩＢＤｖ－ｄｓＲＮＡ、ＡＩＢｖ－ｓｓＲＮＡ、ＥＤＳ７６－ｄｓＤＮＡ、ＭＤＶ－ｄｓＤＮＡ,ＦＰＶ－ｄｓＲＮＡ及ＡＩＬＶ－ｄｓＤＮＡ发生交叉杂交反应。试验结果表明：尽管该探钎含有编码Ｆｏ蛋白酶切位点序列的碱基顺序,但它还是不能把ＮＤＶ的强、弱毒株区分开。这说明ＮＤＶ强、弱毒株比区域内的碱基存在着相当大的同源性。不过,此探针对ＮＤＶ来说具有特异性,这就为ＮＤＶ的诊断技术开创了基因水平检测的新途径。

大肠杆菌内毒素在鸭淀粉样变发生上的作用

淀粉样变病是鸭的一种常见疾病,特别多见于年龄大于1～2年的种鸭群中,发病率通常为5%～10%,但有时可高达30%～40%以上,严重地影响鸭群的生产性能,国外同行认为是引起成鸭损失的主要原因之一。