2022—2023年新冠疫情期间及疫情后手足口病流行病学及分型分析

目的对比了解2022—2023年新冠疫情期间及疫情后广州市和佛山市手足口病流行病学及非肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)非柯萨奇病毒A组16型(Coxsaekievirus group A 16,CA16)病毒的分子流行病学特征,为治疗和防控提供依据。方法运用荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对2022—2023年疑似手足口病患者标本同时进行肠道病毒(enterovirus,EV)通用型、EV71、CA16检测,并选取EV71和CA16是阴性而EV通用型是阳性的标本进行型别鉴定,设计5′非编码区(UTR)引物,RT-PCR扩增后进行序列测定,序列用BLAST程序进行序列的EV型别确定。结果2022年,同时进行EV通用型、EV71、CA163种病毒检测的疑似手足口病例标本共362份,总阳性47份,阳性率为12.98%;其中EV71阳性0份;CA16阳性5份,占1.38%;非EV71非CA16的EV阳性标本42份,占11.60%。2023年,同时进行EV通用型、EV71、CA163种病毒检测的疑似手足口病标本有297份,总阳性100份,阳性率为33.67%,全年没有检出EV71,CA16全年检出率为2.36%(7/297),非EV71非CA16的EV阳性率为31.31%(93/297)。51份非EV71非CA16阳性标本的序列分析表明,2022—2023检出的非EV71非CA16的EV有9种型别,分别为:CA6、CA10、CA4、CA2、CA8、柯萨奇病毒B组5型(CB5)、CB2、CB3、埃可病毒30型(E30),其中CA6占主要,为27.45%(14/51),其次是CA10,占15.69%(8/51)。结论新冠疫情结束后的2023年比疫情期间的2022年EV阳性率高。2022—2023年手足口病主要以非EV71非CA16为主,序列分析表明非EV71非CA16病毒中以CA6和CA10为主,应加强对CA6、CA10为主要非EV71非CA16病毒进行研究及监测。

广州地区婴幼儿感染Noro病毒基因型的初步研究

目的 探讨广州地区婴幼儿腹泻中感染Noro病毒的基因型。方法 用Clustal W比对GⅡ组Noro病毒后，设计处于ORF1与ORF2连接点两旁两对简并引物，进行巢式RT—PCR扩增出目标片段，克隆于T载体上，测定序列，对ORF1与ORF2连接点两旁序列和衣壳蛋白N／S区用Clustal W进行同源性分析，用phylip 3．65软件、邻接法构建进化树。结果 标本NVgz100、NVgz10成功扩增出ORF1与ORF2连接点两旁1208bp片段（相对于Hawaii virus，U07611位置为4476—5683），包含ORF1的3’端RdRp的大部分基因和ORF2基因的5’端的S区。对标本NVgz100、NVgz10与另一实验NVgz01（DQ369797）的1208bp进行同源性分析发现，3份标本与GⅠ组同源性为58％～61％，与GⅡ组同源性为74％～92％；将这3份标本与GⅠ、GⅡ组构建进化树，可发现NVgz100、NVgz10和NVgz01与GⅡ组Bristol等病毒密切相关，将NVgz100、NVgz10和NVgz01的衣壳蛋白N／S区与GⅡ组各基酬型进行同源性比较，发现3份标本与GⅡ4基因型Camberwell、Bristolt Grimsby同源性较高（92％～96％），与其他基因型同源性为70％～73％，以N／S区构建进化树可发现3份标本与Camberwell、Bristol、Grimsby、Lordsdale处于同一簇中。结论 本实验结果表明Noro病毒株以GⅡ组为主，病毒流行的基因型为与Camberwell、Bristol、Grimsby和Lordsdale等密切相关的GⅡ-4基因型。

星状病毒ORF2基因的克隆及进化树分析

目的 探讨广州地区儿童感染的星状病毒ORF2基因特点和基因类型。方法 参考CenBank上的星状病毒Ⅰ型ORF2基因设计了两对特异性引物，进行巢式PCR扩增出目标片段，克隆于T载体上，测定序列，用phylip3．65软件、NJ法构建进化树。结果 星状病毒ORF2基因为2316bp，编码771个氨基酸，ClustalW同源性比较发现，Hastv-gz克隆与4型星状病毒氨基酸同源性为最高（93％），与其它基因型的同源性为61％～70％。结论 广州地区儿童腹泻感染的星状病毒Hastv-gz克隆ORF2基因序列为2316bp，Hastv-gz克隆与4型星状病毒同源性为93％，以phylip3．65软件、NJ法构建ORF2基因进化树中，Hastv-gz与4型星状病毒密切相关，确认Hastv-gz是4型星状病毒。

广州地区健康儿童肠道病毒71型抗体水平调查

目的调查广州地区健康儿童肠道病毒71型抗体IgG（EV71-IgG）的水平,分析与EV71所致手足口病（HFMD）发病的关系。方法以来源于广州市妇女儿童医疗中心（我院）中心实验室分离到的EV71 C4亚型标本,制备EV71诊断抗原,建立EV71-IgG抗体诊断试剂盒方法,并进行实验室评价。收集2010年1~3月在我院儿保科抽血进行常规保健检测的标本,筛选出无发热、无HFMD症状的健康儿童血清标本,检测EV71-IgG抗体。选取我院2010年全年门诊及住院HFMD患儿的咽拭子标本进行EV71特异性核酸检测。结果①本研究建立的试剂盒EV71-IgG抗体检测临界值为0.148;与细胞中和实验方法阳性符合率为100%,阴性符合率为92%,与柯萨奇A16病毒抗体无交叉反应。②819名健康儿童血清标本中,男481名,女338名。〈1岁组（60%,60/100名）和~2岁组（39.3%,72/183名）EV71-IgG抗体阳性率显著高于其他各年龄组[~3岁、~4岁、~5岁和~14岁组分别为12.9%（15/116名）、27.1%（38/140名）、14.2%（16/113名）和22.8%（38/167名）]。EV71-IgG抗体阳性率无显著性别差异。③4 780例EV71阳性HFMD患儿中,男3 070例,女1 718例。〈1岁310例（6.5%）,~2岁1 157例（24.2%）,~3岁1 337例（28.0%）,~4岁1 094例（22.9%）,~5岁450例（9.4%）,~14岁432例（9.0%）。④各年龄组EV71-IgG抗体阳性率与EV71阳性年龄构成比呈相反趋势,〈1岁组EV71-IgG抗体阳性率最高,EV71阳性年龄构成比最低;~3岁组EV71-IgG抗体阳性率最低,EV71阳性年龄构成比最高。结论 〈1岁健康儿童EV71-IgG阳性率最高,EV71阳性年龄构成比与EV71-IgG阳性率呈相关现象。

诺瓦克病毒广州株N蛋白基因的克隆、表达及抗原性鉴定

目的克隆、表达和鉴定诺瓦克病毒广州株NVgz01全长N蛋白。方法在成功构建诺瓦克病毒广州株全基因组克隆并测序的基础上,将全长N蛋白基因克隆到表达载体pET28a(+)上,经IPTG诱导表达后,利用Ni2+亲和层析柱对重组N蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组诺瓦克病毒N蛋白基因在大肠杆菌中可以高效表达,其相对分子质量为62×103,可在Ni2+亲和层析柱上高度纯化;经抗原检测试剂盒检测和免疫学方法分析,均表明重组N蛋白具有良好的抗原性。结论本研究克隆和表达了诺瓦克病毒广州株的全长N蛋白,为诺瓦克病毒诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。

波形蛋白对EV71感染小鼠脑组织引起NLRP3炎性小体活化的影响

目的观察肠道病毒71型(EV71)感染的小鼠中枢神经系统中波形蛋白(VIM)介导NLRP3炎性小体的活化。方法取3~5 d龄的VIM基因敲除型乳鼠(VIM-/-)40只,随机分为EV71感染实验组和空白对照组,20只/组,实验组每只腹腔注射浓度为1×108半数组织培养感染剂量(TCID50)病毒液10μL,空白组腹腔注射无菌PBS 10μL,再将同品质的野生型乳鼠(WT)40只以同样方式分组处理。观察小鼠感染状态1周,提取小鼠脑脊液(CSF)和脑组织全蛋白、RNA及组织切片,通过Western blot、ELISA、RT-PCR检测小鼠中枢神经系统的炎症小体激活状况,以及免疫组化技术考察小鼠中枢神经系统的损伤。结果与空白组比较,VIM-/-实验组小鼠在感染EV71后CSF和脑组织中NLRP3炎症小体及其下游产物IL-1β、caspase-1含量无明显变化;而WT实验组小鼠相较VIM-/-型实验组的NLRP3、IL-1β和caspase-1含量显著升高(P<0.05);同时WT型实验组IL-1β和caspase-1的m RNA拷贝数亦明显高于VIM-/-型实验组小鼠(P<0.05);VIM-/-感染EV71的脑组织神经元受损程度较WT小鼠明显轻微(P<0.05)。结论 EV71通过感染小鼠脑组织诱发VIM基因介导的NLRP3炎症小体活化,释放IL-1β和caspase-1,这可能是中枢神经系统炎症和神经元损伤的原因之一。

婴幼儿腹泻标本病毒学的检测

【目的】了解婴幼儿秋季腹泻中轮状病毒、星状病毒及肠道腺病毒的感染情况,为临床防治提供理论依据。【方法】利用胶体金方法检测婴幼儿秋季腹泻大便标本中的轮状病毒和腺病毒抗原,利用酶联免疫吸附试验方法(ELISA)检测星状病毒。【结果】105份大便标本中,轮状病毒阳性86例,腺病毒阳性77份,星状病毒阳性4份,轮状病毒及腺病毒均阳性56份,轮状病毒及星状病毒均阳性2例,腺病毒及星状病毒阳性2例。【结论】轮状病毒是婴幼儿秋季腹泻的主要原因,其次是肠道腺病毒及星状病毒,且存在混合感染情况。

2004年广州地区流行的3型腺病毒六邻体基因序列分析

[目的]分析2004年夏广州市某幼儿园流行的3型腺病毒(adenovirus type 3,Ad3)的六邻体基因序列,为 Ad3的基础及临床研究提供依据。[方法]采集急性咽结膜炎患儿急性期的眼、咽拭子,提取腺病毒DNA,分两段进行 PCR,扩增腺病毒六邻体基因,将扩增的片断进行T-载体克隆及序列分析。[结果]成功地测出了Ad3六邻体基因序列,并在Genebank登记注册,注册号AY878716,与Genebank中Ad3六邻体基因序列进行同源性比较,同源性为99％。 [结论]腺病毒(Ad3)六邻体基因序列,并与(Genebank中Ad3六邻体基因序列变异是否与其毒力的改变和致病性、传染性相关,尚需作进一步的研究探索。

重症手足口病患儿外周血脑微血管内皮细胞计数的变化及意义

目的探讨普通与重症手足口病患儿外周血脑微血管内皮细胞(BMEC)计数的变化及意义。方法选取8例重症手足口病患儿(重症组),15例普通手足口病患儿(普通组)以及14例非神经系统损伤儿童(对照组)进行分组对照研究,应用免疫磁珠吸附法分离外周血中BMEC,行免疫荧光染色并计数细胞,分析各组患儿外周血BMEC的含量,并分别分析BMEC计数与血液中C反应蛋白(CRP)浓度和白细胞(WBC)含量的关系。结果成功分离出患儿BMEC,其中重症组BMEC、CRP、WBC含量均高于普通组和对照组,差异有统计学意义(F=22.982、5.290、10.631,P<0.01)。BMEC含量与WBC含量呈正相关(r=0.921,P<0.05)。结论重症手足口病患儿外周血BMEC计数显著高于普通手足口病患儿,外周血BMEC计数有望成为早期诊断重症手足口病的新方法。

肠道病毒71型重组VP2蛋白原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP2蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71 VP2基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体形成pET32a(+)/VP2,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分析蛋白表达产物,利用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经Western blot初步验证其抗原性。结果成功构建pET32a(+)/VP2重组质粒,经大肠杆菌表达,纯化获得相对分子质量约为48000的融合蛋白,经Western blot证实其抗原性良好。结论表达并鉴定了VP2抗原,为EV71疫苗研制及检测试剂盒的研发奠定了基础。

清道夫受体蛋白的原核表达及初步鉴定

目的表达清道夫受体B2蛋白(SCARB2),初步鉴定表达产物。方法培养RD细胞,提取其mRNA经逆转录PCR(RT-PCR)方法扩增出scarb2基因片段,构建表达载体pET28a(+)/SCARB2,在原核表达系统(大肠杆菌BL21)中表达SCARB2蛋白,并用His单抗对表达蛋白进行免疫印迹法(Western blot)鉴定。结果构建的重组质粒pET28a(+)/SCARB2经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,重组蛋白SCARB2高效表达并纯化成功,经His单抗初步验证有目的蛋白表达。结论表达并初步鉴定了SCARB2蛋白,为肠道病毒71型(EV71)与清道夫受体蛋白的作用机制及清道夫受体的单克隆制备提供参考。

人博卡病毒广州分离株全基因组序列测定及分析

目的探讨广州地区儿童感染的博卡病毒基因组分子结构特点和基因型类型。方法参考GenBank上的博卡病毒BJ3064株（DQ988933）基因组设计分段扩增引物，进行PCR分段扩增博卡病毒基因组，PCR产物直接送测序公司测序，序列测定，用ClustalW／X和MEGA5．0等软件分析基因组序列。结果博卡病毒全基因组为5299bp，提交到GenBank上的序列号为JNl28956，将GZ2010—1株全基因组核苷酸序列与GenBank上的博卡病毒HBOVl、HBOV2、HBOV3、HBOV4基因型的全基因组序列进行ClustalW比较，发现与HBOVl基因型同源性最高，为98％～99％，而与HBOV2、HBOV3、HBOV4型的同源性分别为76％、81％、75％。将广州分离GZ2010—1株的VPl基因与Genbank上的HBOVl型株进行比较，结果显示与泰国的2株CU49、CU74的同源性为98％，而与HBOVl型其它株：2株标准株（stl、st2）、JPN～193、BJ3064、WLL-1、GD594等株同源性均为99％，F基因的氨基酸序列同源性为99％～100％。结论广州地区儿童感染的博卡病毒GZ2010—1株全基因组序列为5299bp，GenBank序列号为JNl28956，GZ2010—1株属于博卡病毒HBOVl型。

广州地区女性患者泌尿生殖道CT,NG,MG和UU感染状况分析

目的了解广州地区女性患者沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟菌(NG)、生殖支原体(MG)及解脲脲原体(UU)的感染现状,为临床诊疗提供依据。方法收集2017年1月~2018年12月广州市妇女儿童医疗中心就诊的女性患者宫颈分泌物或尿液标本共2388份,采用实时荧光核酸等温扩增检测技术(SAT)对以上标本分别进行CT-RNA,NG-RNA,MG-RNA和UU-RNA检测。结果女性患者CT,UU,NG和MG总阳性率分别为6.57%(157/2388),53.73%(1283/2388),0.63%(15/2388)和1.38%(33/2388),UU检出率显著高于其他三种病原体,差异有统计学意义(χ^2=3561.6,P<0.01)。排在前三位的感染类型分别为:单独UU感染,CT+UU混合感染和单独CT感染,分别占85.51%,8.03%和2.93%。感染人群主要集中在21~30岁年轻女性,临床诊断为泌尿生殖道炎症的女性患者检出率最高,差异有统计学意义(χ^2=173.2,P<0.01)。结论UU是广州地区女性主要的流行病种,在临床诊疗中应重视常见病原体的混合感染,加强育龄期女性的早期筛查和监测。SAT检测能为临床诊断CT,NG,MG和UU感染提供依据。

婴幼儿病毒性腹泻985例粪便标本分析研究

目的探讨婴幼儿病毒性腹泻的流行现状与流行特点。方法采集2008-08-01—2009-07-31广州市儿童医院就诊的急性腹泻患儿粪便标本并记录其病情信息,运用实时荧光定量PCR法对采集的985例患儿粪便标本进行轮状病毒(HRV)、肠道腺病毒(EADV)、诺如病毒(NORV),扎如病毒(SPAV)、星状病毒(ASTV)检测。结果腹泻病毒的年检出率为45.9%,混合感染率为22.8%,未发现GI组NORV株,单月中11月检出率最高76.3%,HRV、NORV、EADV、ASTV、SPAV的年检出率分别是28.0%、13.7%、8.8%、4.9%、1.0%,95%的阳性标本来自2岁以下婴幼儿,水样便、呕吐、发热的发生率为88.9%、75.2%与68.4%。结论病毒性腹泻是本地季节性婴幼儿急性腹泻常见原因,10～12月是发病高峰,2岁以下婴幼儿是主要的流行人群,HRV是最重要的病原体,水样便、发热、呕吐是婴幼儿病毒性腹泻的三联症。混合感染较常见但其症状较单一感染可能并未加重。

广州地区儿童诺如病毒性腹泻的分子流行病学研究

目的应用TaqMan实时荧光逆转录聚合酶链反应（real-timeRT—PCR）法检测诺如病毒（norovirus，NV）的发病情况，为儿童NV腹泻的临床治疗或病毒爆发流行的预防、控制及疫苗的研制提供流行病学资料。方法随机收集2006年12月至2007年12月广州地区急性腹泻病患儿水样便或蛋花汤样便，应用针对病毒ORF1与ORF2连接区域设计的引物及TaqMan探针进行实时荧光RT—PCR检测标本。并将NV阳性标本进行克隆并测序，结合检测结果以确定此周期内NV的流行情况及优势毒株。结果本研究从1260份标本中检测出NV阳性257份（20．40％），其中GⅠ型87份（6．90％），GⅡ型214份（16．98％），GⅠ和GⅡ混合感染44份。测序分析后发现GI毒株检出率依次为GⅠ-3、GⅠ-2及GⅠ-4；GⅡ毒株检出率依次为GⅡ-4、GⅡ-3及GⅡ-7。NV主要感染年龄为2岁以内婴幼儿，发病高峰期在11至12月。结论NV已经成为广州地区婴幼儿腹泻的重要病原体之一，GⅡ-4型是2007年主要流行病毒株。

诺如病毒广州株全基因组序列测定及分析

目的 探讨广州地区儿童感染的诺如病毒基因组分子结构特点和基因组类型。方法 参考GenBank上的诺如病毒MD145-12基因组设计分段扩增引物，进行RT-PCR分段扩增诺如病毒基因组，克隆于T载体上，测定序列，用Clustal W／X、DNAStar、RAT（recombination analysis tool）等软件分析基因组序列。结果 诺如病毒NVgz01全基因组为7558bp，提交到C,enBank上的序列号为DQ369797，3’端非编码区末端长45bp，病毒基因组有3个开放阅读框（ORF），ORF1长5100bp（5～5104nt），ORF2基因长1623bp，位于基因组中5085～6707nt之间，ORF3基因长807bp（6707～7513nt），其中ORF1、ORF2两基因有19个核苷酸的重叠区；NVgz01全基因组核苷酸序列与GenBank上诺如GI组Norwalk68、Southampto、BS5、Chiba、WUG1的同源相似性在43％～44％之间，与GⅡ组MD145、Farmington Hills、B4S5、Hawaii、Lordsdale、SaitamaU1、Mc37同源相似性在76％～90％之间。NVgz01的ORF1与Mc37核苷酸序列同源性为94％，但ORF2与Mc37的同源性只有65％；NVgz01的ORF2与Fannillgton Hills（AY502023）同源性为最高（94％），ORF1的同源性为88％。结论广州地区儿童腹泻感染的诺如病毒NVgz01株全基因组序列为7558bp，GenBank序列号为DQ369797，NVgz01与诺如病毒的GⅡ组同源性较高，确认NVgz01株属于诺如病毒GⅡ组；根据ORF1、ORF2的同源性差异和RAT程序分析初步认为NVgz01可能是重组病毒。

广州地区2007年4238例急性呼吸道感染婴幼儿中人副流感病毒1～3型的研究

人副流感病毒（HPIV）1-3型在婴幼儿中主要引起下呼吸道感染，是引起气管炎和肺炎的重要病原体。实时荧光PCR检测是公认的核酸分子定性和定量检测的标准方法，本研究建立了实时荧光PCR检测HPIV 1～3型的方法，并对2007年广州地区的4238例急性呼吸道感染患儿的临床标本进行检测。

广州检出星状病毒4型的全基因组序列测定及分析

目的探讨广州地区儿童感染的星状病毒基因组分子结构特点和基因型。方法参考GenBank上的星状病毒基因组设计分段扩增引物,进行RT-PCR分段扩增星状病毒基因组,克隆于T载体上,序列测定,用Clustal W和DNAStar软件分析基因组序列。结果星状病毒HASTVgz01全基因组为6721bp,提交到GenBank上的序列号为DQ344027,其中5′端非编码区(5′UTR)长82bp,3′端非编码区末端长81bp,病毒基因组编码区全长6558个核苷酸,分别编码ORF1a、ORF1b、ORF2,ORF1a基因长2763bp(83～2845nt),ORF1b基因长1557bp(2785～4332nt),其中ORF1a、ORF1b两基因有71个核苷酸的重叠区；ORF2全长2316nt,位于基因组中4325～6640nt。ASTVgz01与GenBank中8种基因型星状病毒的ORF2基因氨基酸序列同源性比较发现,HASTVgz01与4型的同源性为93％,其他的同源性在61％～70％之间。结论广州地区儿童腹泻感染的星状病毒HASTVgz01全基因组为6721 bp,GenBank序列号为DQ344027,HASTVgz01与4型星状病毒的ORb2基因氨基酸序列比较同源性为最高,确认HASTVgz01是4型星状病毒。

儿童呼吸道腺病毒基因分型方法的建立及其应用

目的利用PCR技术，建立引起儿童呼吸道感染的腺病毒的基因分型方法，便于推广和应用。方法分析GenBank中不同型别腺病毒的六邻体基因序列特点，设计不同型腺病毒的特异性引物，以PCR方法进行基因分型，建立基因分型方法，并利用此方法对广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒感染进行了基因分型。结果建立了呼吸道腺病毒的基因分型方法。广州市2004年7月某幼儿园流行的腺病毒为3型腺病毒。结论PCR方法可进行腺病毒的基因分型，且简便、结果可靠，便于推广应用。