杧果炭疽病菌漆酶基因Cglac3序列特征及其在两个侵染相关基因突变体中的表达分析

本研究运用同源克隆技术克隆了杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的Cglac3漆酶基因,并采用实时荧光定量PCR分析了该基因在侵染过程、漆酶基因LAC1突变体、外切葡聚糖酶基因CgCBH1突变体中的差异表达情况。结果表明,杧果炭疽病菌漆酶Cglac3基因大小为1842 bp,含3个内含子,大小分别为56、51、58 bp。Cglac3开放读码框编码558个氨基酸,蛋白分子量为61.38 kDa,等电点(PI)为4.50。与未侵染对照0 h的表达量相比,Cglac3在6 h孢子萌发形成附着胞时表达量迅速升高,在12 h侵入寄主后达到最高,之后在菌丝扩展、叶片显症过程中出现波动,但均远高于0 h的表达量,显示Cglac3在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用,可能是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。与野生型相比,Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1敲除突变体中下降了74%,在外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除突变体中下降了56%;在CgCBH1缺失敲除突变体中,LAC1的表达下降了68%,与Cglac3的表现趋势一致,说明Cglac3的表达受LAC1调控,外切葡聚糖酶基因CgCBH1也会影响Cglac3和LAC1的表达。

漆酶基因Cglac10的缺失对杧果炭疽病菌无性繁殖和侵染能力的影响

【目的】揭示漆酶基因Cglac10在杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)生长及侵染致病过程中的功能。【方法】利用qPCR技术对Cglac10在该菌侵染过程中的表达进行分析,并通过同源重组和PEG介导的原生质体转化法获得敲除突变体ΔCglac10H和回复菌株C-ΔCglac10H。【结果】Cglac10基因在侵染过程中的表达量是侵染前的8.02~13.66倍。回复菌株C-ΔCglac10H的表型与野生型菌株的无显著差异;突变体ΔCglac10H除在菌丝生长速率方面与野生型菌株差异不明显外,菌落颜色变为白色,培养10 d时菌丝中黑色素含量下降了67.33%,产孢量显著下降;在水膜中培养至24 h时,ΔCglac10H才偶见形成附着胞,36 h时的形成率仅为野生型菌株的44.85%;在PDB中培养6 d后,ΔCglac10H的胞内漆酶活性较野生型菌株下降了57.61%;不刺伤时,ΔCglac10H几乎不致病,刺伤接种6 d后,观察到ΔCglac10H的致病力比野生型菌株下降了52.94%。【结论】Cglac10在C.gloeosporioides无性繁殖及侵染致病过程中起着重要作用。

GFP标记杧果露水斑病病原菌及其侵染部位的确定

由枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)侵染引起的杧果露水斑病是近年杧果上新发生的病害,主要为害果实。明确该菌能否穿透果皮侵入果肉,可为防治该病害选择合适的药剂提供依据。本研究将绿色荧光蛋白基因gfp和潮霉素抗性基因hygB表达盒插入了经定点突变后Cl.cladosporioides的ITS序列中,成功构建了pITGH重组载体,将其用PEG介导方法转化杧果露水斑病菌原生质体,获得了在菌丝、分生孢子、萌发的分生孢子中稳定发出绿色荧光的GFP标记菌株,该标记菌株与野生菌的菌落形态、颜色及致病力无明显差异,生长速度明显慢于野生菌。用该标记菌株观察侵染过程,发现杧果露水斑病菌可以在杧果果皮上侵染和扩展,但不能扩展至果肉中。该结果为选择农药类型提供了依据,也为进一步研究该病菌在活体杧果上的生物学、预测病害和通过观察定殖情况确定杧果品种的抗病性等奠定了良好的材料基础。

杧果炭疽病菌3个果胶裂解酶基因序列特征及受漆酶基因Lac1影响的分析

果胶裂解酶是炭疽菌在侵染寄主过程中降解寄主细胞壁的一类重要水解酶。本研究在杧果炭疽病菌中克隆获得了3个果胶裂解酶基因Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3,DNA全长分别为1 037、1 498、1 089 bp,cDNA全长分别为975、1380、978bp,分别编码324、459、325个氨基酸,均含1个果胶裂解酶保守结构域,均有典型的信号肽,不存在跨膜结构。其二级结构中α-螺旋分别占16.05%、20.26%、16.92%,延伸链分别占28.09%、21.79%、29.54%,β-转角分别占5.86%、8.93%、7.38%,无规则卷曲分别占50.00%、49.02%、46.15%。Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3的氨基酸序列分别与C. tofieldiae(KZL77240.1)、草莓炭疽菌(C. gloeosporioides)(XP-007274932.1)、C. incanum(KZL84476.1)果胶裂解酶序列相似度在93%以上。qRT-PCR分析发现,3个果胶裂解酶基因在整个侵染过程中均持续高效表达,但在漆酶基因Lac1敲除突变体中,表达均下降约90%。可见Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3是果胶裂解酶基因家族成员,序列差异较大,在侵染过程中起着重要的作用,且其表达受漆酶基因Lac1影响。

杧果露水斑病菌和细菌性黑斑病菌双重PCR体系的建立

杧果露水斑病和细菌性黑斑病在国内杧果产区普遍发生,严重威胁杧果安全生产,俗称杧果"两病"。建立准确高效的检测方法,提早检出杧果两病并及时采取防治措施,可有效减轻为害。本实验通过筛选反应体系和电泳条件,建立了可同时检测杧果中的露水斑病菌和细菌性黑斑病菌的双重PCR检测体系。结果表明:25μL反应体系,2×Taq PCR MasterMix 12.5μL,引物ML-SF9/SR5 (10μmol/L)各1.5μL、XcmHF/HR(10μmol/L)各1μL,模板各1μL,加ddH2O补足至25μL。反应条件为94℃预变性4 min;94℃变性45 s,65℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸5 min。电泳检测条件为1.5%琼脂糖凝胶浓度、120 V电压电泳25 min。该体系检测下限为杧果露水斑病原菌g DNA 0.224 ng/μL、细菌性黑斑菌液2.6×1~04cfu/m L。该技术可应用于田间杧果"两病"的早期检测与鉴定工作中。