敲低热休克转录因子5(Hsf5)对小鼠睾丸间质细胞和支持细胞中热休克家族的影响

目的探讨敲低热休克转录因子5(Hsf5)对小鼠睾丸间质细胞(TM3)和支持细胞(TM4)中热休克家族表达的影响。方法培养小鼠TM3和TM4细胞,随机分为对照组(control group)和Hsf5敲低组(Hsf5 knockdown group)。用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测两种细胞中热休克转录因子(HSFs)和热休克蛋白(HSPs)mRNA的表达。根据RT-qPCR结果分别选取两种细胞中变化具有显著差异的HSPs(P<0.01),应用Western blot检测TM3细胞中HSPA2、HSPA5、HSP90ab1和TM4细胞中HSPA2、HSP90aa1蛋白表达。结果用siRNA干扰技术成功构建Hsf5敲低模型。敲低Hsf5后,TM3细胞中Hspa2、Hspa5、Hsp90ab1和TM4细胞中Hsf2、Hspa2、Hsp90aa1、Hsp90ab1、Hspd1的mRNA表达明显下调(P<0.05)。与对照组相比,在Hsf5敲低组中,TM3细胞中HSPA2、HSPA5和TM4细胞中HSPA2蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论HSF5可能通过调控小鼠睾丸间质细胞和支持细胞中HSPA2和HSPA5的表达参与精子发生。

热休克转录因子5在小鼠睾丸不同细胞中的表达及其功能探索

目的探讨热休克转录因子5(heat shock transcription factor 5,HSF5)在小鼠睾丸不同细胞中的表达情况及其功能。方法培养3种(GC-2、TM3、TM4细胞)小鼠睾丸组织细胞,并通过RT-qPCR绝对定量测定HSF5的mRNA表达水平。利用siRNA干扰技术,针对高表达HSF5细胞进行hsf5基因敲低,通过RT-qPCR和Western blot检测其他几种热休克转录因子以及热休克蛋白表达情况。建立脂多糖感染高表达HSF5细胞模型,分为无脂多糖对照组、脂多糖对照组、脂多糖hsf5敲低组,通过ELISA法测定细胞上清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6水平。结果同TM3、TM4细胞相比,GC-2细胞中HSF5的mRNA表达量最高。敲低GC-2中的HSF5表达后,HSF1以及HSP60的mRNA表达下调(P<0.05);HSF1的蛋白表达量也出现下调(P<0.05)。脂多糖感染GC-2细胞模型建模成功,同脂多糖对照组相比,脂多糖hsf5敲低组中的IL-6、IL-1β水平降低(P<0.05)。结论3种小鼠生殖细胞中,GC-2中HSF5的mRNA表达量最高;HSF5在小鼠生殖细胞中极可能充当了免疫保护的角色进而参与精子的发生从而影响男性不育。

精子发生调控因子重组人HSF5的原核表达、活性检测与结构预测

目的表达可溶性重组人源热休克转录因子5(rhHSF5)蛋白,并对其与热休克元件(HSEs)结合的结构模型进行预测。方法将目的基因克隆到表达载体pET-22b(+)上,然后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,挑取单克隆,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。通过Ni-NTA亲和层析、Superdex 75分子筛层析纯化后,获得重组蛋白。与包含HSEs的DNA片段进行凝胶迁移实验,并通过同源建模和分子动力学模拟研究方法对其与HSEs结合的结构进行模拟和预测。结果获得可溶性人源HSF5蛋白的表达;经纯化得到高纯度、可结合HSEs的重组蛋白;凝胶迁移实验可见它与含HSEs的寡聚核苷酸有结合。结论可溶性的人源HSF5蛋白可在原核系统中表达,为进一步研究HSF5的功能机制提供了基本条件。