杂交兰ChCAO基因克隆及其在叶艺品系中的表达特征

【目的】叶绿素酸酯a加氧酶(CAO)是叶绿素b形成过程中的关键酶,对杂交兰CAO基因进行克隆及表达特征分析可为探究其在杂交兰叶艺形成中的调控作用奠定基础。【方法】以杂交兰‘紫妍氏’(K21)及其叶艺品系‘中透紫妍氏’(K21-3)为试验材料,用RT-PCR和RACE技术从叶片中克隆获得ChCAO基因,对ChCAO进行结构特征、理化性质、序列比对以及系统进化关系等分析;用qRT-PCR法对ChCAO在不同组织及叶艺品系叶片中的表达特性进行分析;并用VIGS技术对ChCAO进行沉默表达。【结果】ChCAO基因编码区长1608 bp,编码535个氨基酸,ChCAO与墨兰CAO亲缘关系最近,并与其他兰科植物CAO聚为一类。qRT-PCR结果显示,ChCAO基因表达具有组织特异性,在叶中相对表达量最高,根中相对表达量最低;此外,ChCAO在K21绿叶和K21-3绿叶区域叶片中的相对表达量显著高于K21-3叶艺区域叶片中的相对表达量。构建该基因的VIGS沉默载体转化烟草,发现沉默ChCAO后烟草叶片呈黄化状态,叶片中的叶绿素含量及ChCAO基因的相对表达量也显著降低。【结论】克隆获得了杂交兰ChCAO基因,并对其功能进行了初步鉴定,为进一步研究杂交兰叶艺形成机理提供重要依据。

文心兰花粉离体萌发培养基的筛选及萌发率的测定

【目的】研究不同培养基组分、培养温度及培养时间对文心兰花粉离体萌发的影响,以期筛选出文心兰花粉离体萌发的适宜培养基及培养条件,为文心兰种质资源创新利用提供科学依据。【方法】以盛花期当天开放的花朵为试验材料,采用液体培养基,比较蔗糖、H_(3)BO_(3)、Ca(NO_(3))·4H_(2)O、MgSO_(4)·7H_(2)O及KNO_(3)对文心兰花粉离体萌发的影响,正交试验筛选文心兰花粉离体萌发培养基的最佳组合及培养条件;在此基础上,测定收集保存的68份文心兰种质资源的花粉离体萌发率。【结果】一定质量浓度的蔗糖、H_(3)BO_(3)、Ca(NO_(3))·4H_(2)O、MgSO_(4)·7H_(2)O及KNO_(3)对文心兰花粉的离体萌发具有一定的促进作用,各因素的最佳作用效果从高到低依次为H_(3)BO_(3)、Ca(NO_(3))·4H_(2)O、蔗糖、MgSO_(4)·7H_(2)O及KNO_(3)。正交试验表明适宜的液体培养基组合为100 g·L^(-1)蔗糖+10 mg·L^(-1)H_(3)BO_(3)+50 mg·L^(-1)Ca(NO_(3))·4H_(2)O+20 mg·L^(-1)MgSO_(4)·7H_(2)O+30 mg·L^(-1)KNO_(3),各成分的质量浓度与单因素试验的结果一致;培养条件为25℃、黑暗培养48 h。文心兰花粉离体萌发测定结果表明,60.29%的种质资源的花粉能离体萌发,萌发率普遍较低,为0.74%~49.65%。【结论】筛选出文心兰花粉离体萌发适宜的液体培养基组合及培养条件,不同文心兰种质资源的花粉离体萌发率存在明显差异,本研究结果可为后续文心兰种质资源的创新利用及他人研究等提供参考。

兰科植物花粉离体萌发与贮藏研究进展

兰科植物中普遍存在自交不育、杂交不亲和及花期不遇等现象,因此,研究花粉生活力和贮藏条件成为人工授粉的重要前提。花粉离体萌发是测定花粉生活力的重要方法,本文总结了兰科植物花粉离体萌发与贮藏的研究进展,对花粉离体萌发中的花粉采集、培养基成分、培养条件,花粉贮藏中的贮藏温度、花粉含水量等进行了综述;并对花粉萌发与贮藏的研究方向进行了展望。

基于高通量测序的建兰转录组信息分析

为获得建兰转录组信息,以花发育3个时期为研究对象,进行转录组测序、组装、注释及差异基因分析。结果表明:共获得120.86 Gb clean reads,组装得到56804个Unigenes,平均长度为1502 bp,其中34324条Unigenes获得注释,占所有Unigene的60.43%。33908条Unigenes在NR数据库中得到注释,与石斛的匹配度最高;18459条Unigene被注释到GO数据库中的50个分支;在KEGG中共注释到13145条Unigene,11662条注释到129个KEGG通路中。差异基因聚类分析表明,7873个差异基因,其中3934个上调表达,3939个下调表达。差异基因的KEGG注释中,花香相关途径差异基因较多。利用MISA软件筛选得到19737个SSR位点,其中单核苷酸重复SSRs数量最多,有13291个,二核苷酸重复次之,有3374个。本研究为后期建兰基因功能验证及次生代谢解析提供基础数据。

建兰种子无菌萌发及根状茎增殖分化研究

以建兰杂交种子为外植体,通过探索果荚采收时间、植物生长调节剂(6-BA、NAA)等关键因子对建兰种子萌发、根状茎增殖与分化的影响,探讨建兰种子无菌萌发及根状茎增殖与分化关键技术。结果表明:果荚最佳采收时期为花后8~10个月,种子萌发的适宜培养基为1/2MS+花宝1号1.5 g·L^(-1)+6-BA 2.0 mg·L^(-1)+NAA 0.2 mg·L^(-1)+AC 0.3 g·L^(-1);根状茎增殖的适宜培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg·L^(-1)+NAA 1 mg·L^(-1)+AC 0.3 g·L^(-1),增殖系数达5.34;根状茎分化的适宜培养基为1/2MS+6-BA 2.0 mg·L^(-1)+NAA 0.3 mg·L^(-1)+AC 0.3 g·L^(-1),分化率达56%。

文心兰组培苗繁育技术规程

为了规范文心兰组培苗的生产、保证种苗质量,从组培苗繁育中的母株选择、外植体选取、外植体消毒、诱导培养、增殖培养、分化培养、生根培养、炼苗、试管苗质量,组培苗移栽中的环境条件、洗苗与消毒、基质、移栽、栽培管理、移栽苗质量等方面,总结出文心兰组培苗繁育技术规程,为文心兰组培苗标准化生产提供依据。

基于EST-SSR标记的金线莲叶色突变体分子身份分析

【目的】为金线莲(Anoectochilus roxburghii)从DNA分子水平上探索叶色突变体的遗传差异。【方法】采用EST-SSR分子标记技术对金线莲及其2个叶色突变体进行分子鉴定。【结果】20对SSR引物共扩增出78条谱带,其中3对引物(JXL-6、JXL-14和JXL-16)能稳定扩增出差异条带,多态性条带9条,多态性比率11.54%。【结论】获得的2个叶色突变体为金线莲突变体,叶色突变体与亲本在DNA分子水平差异较小。

杂交兰及其花艺突变体中类黄酮成分差异的代谢-转录组联合分析

为探索杂交兰花艺突变体变异的分子机理,该研究以杂交兰‘玉凤’及其花艺突变体‘双艺金龙’为材料,利用靶向代谢组学和转录组学鉴定两者中类黄酮化合物含量差异及其相关通路上的差异表达基因。结果表明:(1)代谢组分析发现,杂交兰‘玉凤’和‘双艺金龙’花瓣中共检测到271种类黄酮代谢物,其中黄酮醇类和黄酮类代谢物的相对含量约占总类黄酮的30%~50%;共检测到38个差异代谢物(15个上调,23个下调);‘玉凤’中差异最高的代谢物二氢山奈酚-7-O-葡萄糖苷(黄酮醇类)含量是‘双艺金龙’的124444倍,‘双艺金龙’中差异最高的代谢物3,5,7,3′,4′-五羟基-5′-异戊二烯基黄酮(黄酮醇类)含量是‘玉凤’的7244倍。(2)KEGG分析显示,差异代谢物显著富集在类黄酮、黄酮和黄酮醇生物合成途径。其中,在类黄酮生物合成途径上,根皮苷、黄腐醇、二氢山奈酚、二氢杨梅素和表没食子儿茶素含量升高,柚皮苷和二氢槲皮素含量降低;在黄酮和黄酮醇生物合成途径上,三叶豆苷和槲皮素含量均下降。(3)转录组分析共筛选到563个差异表达基因,与‘玉凤’相比,‘双艺金龙’中有220(39.1%)个基因上调表达,343(60.9%)个基因下调表达;KEGG分析发现,与类黄酮生物合成相关的差异基因(CCoAOMT、CHS、CHI、F3H和FLS)被显著富集。(4)qRT-PCR验证结果显示,‘双艺金龙’中类黄酮生物合成相关基因(CHS2、CHS3、CHI、F3H、FLS)以及转录因子基因HD-ZIP的表达量较‘玉凤’均显著下降,其表达量的变化趋势与代谢物含量的变化趋势一致。研究认为,类黄酮生物合成相关基因的低表达,使下游代谢物合成受阻,进而导致‘双艺金龙’花艺的产生;推测类黄酮生物合成途径中的基因可能是杂交兰花色变化的关键基因。

4种姜荷花苞片色素成分特征分析

为了解姜荷花苞片颜色多样性及其色素成分,对4种姜荷花在颜色表现有差异性的上、下部苞片进行了色素成分的初步分析。通过显色反应、黄酮类化合物特征颜色反应和紫外-可见光谱扫描,分析了4种姜荷花不同苞片中的色素组成。结果表明:红火炬上苞片、金銮红上苞片所含色素主要为黄酮和花色素苷;红火炬下苞片、多东上苞片所含色素主要为二氢黄酮(醇)和花色素苷;黄色梦幻上苞片和下苞片所含色素主要为黄酮和叶绿素;多东下苞片、金銮红下苞片所含色素主要为异黄酮、花色素苷和叶绿素。研究结果说明了姜荷花不同色系苞片的色素成分存在明显差异,红色系苞片所含的主要色素成分为花色素苷和其他黄酮类化合物;黄绿色系和杂色系苞片的主要呈色色素为黄酮类化合物和叶绿素。

8个春石斛栽培种花瓣挥发性成分差异分析

为研究不同春石斛栽培种花瓣中挥发性成分组成特点及其差异,采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱(GC-MS)技术,分析了杂交紫花、黑毛珍珠、红爵士、火鸟公主、黄钻戒、台湾公主、大汉王后和耳环等8个春石斛栽培种花瓣挥发性成分及其相对含量,并应用主成分分析和聚类分析确定品种间的亲疏关系。结果表明:8个栽培种共检测到130种挥发性成分,以萜烯类化合物为主;春石斛花瓣中的主要挥发性成分为β-罗勒烯、β-石竹烯、芳樟醇、α-蒎烯、水杨酸甲酯和辛醇,因其组成和含量的变化导致了品种间的香气感官差异;主成分分析结果显示8个栽培种具有明显的区域分布特征。此外,聚类分析将8个栽培种分为3组:黑毛珍珠和杂交紫花为一组,火鸟公主、红爵士和黄钻戒为一组,台湾公主、大汉王后和耳环为一组。该研究结果为春石斛香气物质的利用和香型品种的培育提供了参考。

植物生长调节剂对杂交兰株型矮化的影响

为了探索杂交兰株型矮化的化学控制,以杂交兰紫妍氏及其叶艺品种福韵西施为材料,通过喷施多效唑(PP 333)、烯效唑(S3307)、矮壮素(CCC)等植物生长调节剂,比较分析喷施植物生长调节剂后的植株高度、植株宽度、新芽高度和新芽宽度,筛选出控制紫妍氏和福韵西施株型矮化的最佳植物生长调节剂和浓度。结果表明:喷施3种植物生长调节剂均能在一定程度上控制杂交兰株型矮化,从紫妍氏株型矮化整体效果来看,烯效唑的效果优于多效唑和矮壮素,其中150、200 mg·L^(-1)效果最为显著;从福韵西施株型矮化整体效果来看,200 mg·L^(-1)烯效唑和2000 mg·L^(-1)矮壮素是较优的选择。

小苍兰花色色素成分及稳定性分析

以小苍兰(Freesia refracta)16个不同花色品种及后代为试验材料,对花瓣色素用特征显色反应和紫外-可见光谱扫描,分析其色素的成分和花色素苷的稳定性。结果表明,小苍兰花色的色素属于类黄酮化合物,含黄酮和花色素苷类物质,可能含有异黄酮,不含黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮和橙酮,其中黄色系品种及后代还含有类胡萝卜素。避光下小苍兰花色素苷的稳定性要强于光照;温度对花瓣色素的稳定性有一定的影响。

中小花型蝴蝶兰种质遗传多样性的形态与SRAP分析

采用形态学标记与SRAP分子标记相结合的方法对31个中小花型蝴蝶兰种质资源的遗传多样性进行评价。其中SRAP标记中,筛选出的10对引物组合共扩增出150条谱带,其中130条为多态性（85.0%）;各种质间的相似系数变化范围为0.36~1.0,平均为0.66。聚类分析表明,形态学标记将其划分为4大类群,SRAP标记将其划分为2大类群,同时SRAP标记聚类结果中发现种质Ph-R317与Ph-R318为同一品系。两种标记聚类结果并不一致,在一定程度上可起到互补的作用。

观赏向日葵种质资源遗传多样性RAPD分析

利用RAPD标记技术,从90条随机引物中筛选出16条对16个观赏向日葵种质资源进行DNA水平上的多态性检测,共获得242条DNA片段,大小分布在200～2800bp之间,其中162条带具有遗传多态性,约占总数的66.9%,揭示了观赏向日葵较为丰富的遗传多样性。16个观赏向日葵的遗传相似性分析表明,各基因型间的Nei氏相似性系数分布在0.36～0.84之间,平均相似性系数为0.5903;聚类分析结果在一定程度上可区分出不同的基因型,多数来源相同的种质资源表现出较为密切的亲缘关系。

杂交兰‘紫妍氏’叶艺性状的生理生化与细胞结构分析

该研究以杂交兰‘紫妍氏’(K21)及其3个叶色变异(叶艺)新品系(K21-1、K21-2、K21-3)为材料,分析叶片光合色素含量、叶绿素合成前体物质含量、叶绿素合成相关酶活性及叶绿素荧光参数变化,并进一步观察叶片显微结构和叶绿体超微结构,以探讨其叶色变异的生理基础。结果表明:(1)3个叶艺品系叶片叶艺区域的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均显著低于其相应的绿色区域和亲本绿叶;相较于相应的叶片绿色区域,K21-1、K21-2叶片叶艺区域的UrogenⅢ大量积累,K21-3叶片叶艺区域的PBG大量积累;3个叶艺品系叶片叶艺区域中的光系统Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)和实际光化学效率[Y(Ⅱ)]均显著低于叶片绿色区域,三者的光化学淬灭系数(qP)则显著高于叶片绿色区域。(2)在显微结构和叶绿体超微结构比较中,相较于叶片绿色区域,叶片叶艺区域的细胞中含较少的叶绿体,且叶绿体的发育成熟程度较低,其中K21-3呈现出一种空腔化的结构。研究推测,叶绿素前体物质合成受阻、叶绿体结构发育不良和叶绿素含量下降是杂交兰3个叶艺品系叶艺形成的原因。该研究从生理和细胞层面初步解释了杂交兰叶艺形成的可能原因,为进一步开展相关分子机理研究及合理利用种质资源奠定了理论基础。

中国水仙花色相关基因的克隆与分析

【目的】克隆并初步分析与中国水仙花色发育相关的八氢番茄红素合成酶(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和番茄红素β-环化酶(LycB)等3个酶基因序列及结构,了解其花色形成的分子机制,为进一步研究中国水仙类胡萝卜素代谢基因工程奠定基础。【方法】以中国水仙花瓣的mRNA为模板,采用RT-PCR技术扩增PSY、PDS和LycB等3个关键酶基因的保守序列,并进行序列结构分析。【结果】分离得到的中国水仙PSY、PDS和LycB的保守序列长度分别为343、500和486bp,分别编码112、166、161个氨基酸。基因比对结果表明,推导氨基酸序列与已知其他不同植物均具有较高同源性,分别为76.5%～96.1%、69.8%～98.3%和77.3%～95.5%,且包含PSY、PDS和LycB酶的相关功能结构域,初步证明为目标基因,不同物种间的PSY、PDS和LycB基因具有相当高的保守性。编码蛋白预测结果发现,PSY、PDS和LycB虽然有部分疏水区域,但是不存在明显的跨膜结构域。【结论】研究结果为进一步了解中国水仙花色相关酶基因的调控功能及花瓣着色机理奠定分子基础。

杂交兰种质资源遗传多样性的SRAP分析

采用SRAP技术对24份杂交兰种质资源的遗传多样性进行分析。筛选出的11对引物组合共扩增出119条谱带,其中102条为多态带,多态性比率86.1%,平均每对引物组合产生9.3个多态性位点。各种质之间的相似系数变化范围为0.43～0.98,平均为0.67。UPGMA聚类分析表明：在遗传相似系数0.69处将24份供试材料划分为5个类群,较好地揭示了杂交兰种质间的遗传多样性与亲缘关系,可为杂交兰种质资源利用、杂交育种亲本选择及杂种后代鉴定提供科学依据。

植物生长调节剂对杂交兰‘双艺金龙’株型控制的影响

为探明多效唑(PP333)、烯效唑(S3307)、矮壮素(CCC)、比久(B9)等植物生长调节剂对杂交兰株型控制的影响,本研究以杂交兰‘双艺金龙’为材料,在喷施不同种类和浓度植物生长调节剂后,对株高、株幅、叶片长度、叶片宽度、新芽高度、新芽宽度等指标进行比较分析。结果表明,从株型控制的整体效果来看,4种植物生长调节剂的喷施均有控制杂交兰株型的作用,作用效果优劣先后排序为烯效唑、多效唑、矮壮素和比久,特别是喷施200 mg·L^(-1)烯效唑和800 mg·L^(-1)多效唑的株型控制效果最为显著。本研究结果为杂交兰株型控制的进一步研究提供了科学依据。

蝴蝶兰花青素苷合成途径关键酶基因的克隆与表达

采用RT-PCR技术从蝴蝶兰‘满天红’花瓣中克隆获得花青素苷生物合成途径中CHS、DFR、F3′5′H和ANS等4个关键酶基因的保守序列,长度分别为302、275、285和285bp。序列分析表明:4个关键酶蛋白与石斛兰、大花蕙兰等其他植物来源的花青素苷生物合成相关蛋白均具有较高的同源性,分别为81%～95%、67%～91%、68%～92%和83%～89%。系统进化分析表明4个关键酶基因的系统进化基本上符合植物分类学分类。实时荧光定量PCR检测结果表明,CHS和F3′5′H基因在大花蕾期及始花期的表达量最高,盛花期表达量降低;在花瓣、唇瓣中的表达量大于萼片,在叶片、根中仅有微量表达。

甘蔗杂种真实性鉴定研究综述

甘蔗是世界和中国最重要的糖料作物,甘蔗发展,品种是关键,而杂种鉴定是选育新品种的一个重要措施。在此,综述了甘蔗杂种真实性鉴定中常用的形态标记鉴定、细胞学标记鉴定、生化标记鉴定和目前比较先进的分子标记鉴定的研究进展,指出各种鉴定方法的优缺点,探讨遗传标记在甘蔗杂种鉴定研究中的应用前景。