阻滞PERK信号通路增强人骨肉瘤HOS细胞对MPPa-PDT疗法的敏感性

目的观察蛋白激酶样内质网激酶(RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)通路在焦脱镁叶绿酸-a甲酯介导的光动力疗法(pyropheophorbide-a methyl ester-mediated photodynamic therapy,MPPa-PDT)诱导人骨肉瘤HOS细胞凋亡、自噬中的作用,并探讨阻滞PERK通路增强人骨肉瘤HOS细胞对MPPa-PDT敏感性的影响及机制。方法 MPPa-PDT处理人骨肉瘤HOS细胞后以Hoechst染色观察胞核形态学变化。以空白组、MPPa组、LED组为对照组,以MPPaPDT处理组(MPPa-PDT)、MPPa-PDT联合PERK通路抑制剂GSK2656157处理组(MPPa-PDT+GSK2656157)、MPPa-PDT联合自噬抑制剂Bafilomycin A1处理组(MPPa-PDT+Bafilomycin A1)为实验组。采用Western blot检测PERK通路相关蛋白PERK、p-PERK、ATF4、CHOP,凋亡相关蛋白Cleavedcaspase3、Cleaved-PARP,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62的表达,免疫荧光检测p-PERK表达变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 MPPa-PDT诱导人骨肉瘤HOS细胞凋亡、自噬、PERK通路激活,细胞核呈固缩、碎裂等凋亡形态学变化。与空白组、MPPa组、LED组比较,MPPa-PDT组Cleavedcaspase3、Cleaved-PARP、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-PERK、ATF4、CHOP表达升高,p-PERK荧光强度增强(P<0.05),而P62、PERK表达降低(P<0.05)。与MPPa-PDT组比较,MPPa-PDT+GSK2656157组p-PERK、ATF4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达降低,p-PERK荧光强度减弱,PERK、P62、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP表达升高,凋亡增强(P<0.05);与MPPa-PDT组比较,MPPa-PDT+Bafilomycin A1组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP表达升高,凋亡增强(P<0.05);与MPPa-PDT+GSK2656157组比较,MPPa-PDT+Bafilomycin A1组p-PERK、ATF4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达升高,PERK、Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP表达降低,凋亡减弱(P<0.05)。结论 MPPa-PDT可激活PERK通路,诱导保护性自噬及未折叠蛋白反应,从而促细胞存活。阻滞PERK通路可解除该作用,增强MPPa-PDT对人骨肉瘤HOS细胞的杀伤作用。

沉默GRP78表达增强HOS细胞对MPPα-PDT敏感性的研究

目的:观察葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在焦脱镁叶绿酸-α甲酯(MPPα)介导的光动力疗法(PDT)(MPPα-PDT)处理骨肉瘤HOS细胞中的作用,并探讨沉默GRP78表达增强HOS细胞对MPPα-PDT敏感性的可能机制。方法:MPPα-PDT作用于HOS细胞24 h后,Hoechst染色观察胞核形态学变化。采用Western blot检测MPPα-PDT 3 h、6 h、12 h和24 h处理HOS细胞后GRP78蛋白的表达水平;运用脂质体法将特异性针对人siRNA-GRP78转染HOS细胞后,分为Control组、siRNAGRP78组、siRNA-GRP78+MPPα-PDT组及MPPα-PDT组,细胞免疫荧光法检测GRP78表达,CCK-8检测HOS细胞增殖活性,Western blot检测细胞增殖相关蛋白、凋亡相关蛋白及Wnt通路相关蛋白的表达;流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。结果:MPPα-PDT可诱导骨肉瘤HOS细胞凋亡及GRP78表达增加;有效转染siRNA-GRP78后,HOS细胞中GRP78的mRNA及蛋白表达均下降,GRP78平均荧光强度降低(P<0.05),细胞增殖蛋白PCNA、Ki67表达水平下降(P<0.05),凋亡相关蛋白CleavedPARP、Cleaved-Caspase 3的表达水平上调(P<0.05),Wnt通路相关蛋白表达下降。结论:MPPα-PDT可诱导骨肉瘤HOS细胞凋亡及GRP78表达增加;siRNA-GRP78有效沉默GRP78表达后,HOS细胞增殖活性降低,凋亡水平增加,并增加HOS细胞对MPPα-PDT的敏感性,其机制可能与抑制Wnt通路激活相关。

雷公藤红素通过内质网应激相关通路促进人骨肉瘤HOS细胞凋亡

目的:观察雷公藤红素对人骨肉瘤HOS细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 :用不同浓度(0、1.5、2.5、3.5和4.5μmol/L)的雷公藤红素处理骨肉瘤HOS细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活性,确定最佳实验浓度。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,Hoechst33258染色后相差显微镜观察细胞凋亡的形态学改变,FCM法检测细胞凋亡率和细胞内Ca2+浓度变化,蛋白质印迹法检测结合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein,BIP)、钙联蛋白(calnexin,CNX)、内质网氧化还原酶1-Lα(endoplasmic reticulum oxidoreductin 1-L alpha,Ero1-Lα)、蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)、肌醇依赖酶1(αinositol-requiring enzyme 1 alpha,IRE1α)、蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)和磷酸化PERK(phosphorylatedPERK,p-PERK)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancerbinding protein homologous protein,CHOP)、剪切型caspase-12(cleavedcaspase-12,c-caspase-12)和c-caspase-3的表达变化。结果 :不同浓度的雷公藤红素均可抑制HOS细胞活性(P值均<0.05),且呈浓度依赖性。3μmol/L雷公藤红素处理24 h后,HOS细胞形态明显萎缩、紊乱,漂浮细胞增多,且出现明显核固缩和核碎裂等典型的细胞凋亡形态学改变。与未处理对照组相比,3μmol/L雷公藤红素处理24 h后细胞凋亡率和细胞内Ca2+浓度明显升高(P值均<0.05)。3μmol/L雷公藤红素处理24 h后,内质网应激相关标志蛋白BIP、CNX、Ero1-Lα、PDI、IRE1α和p-PERK以及内质网应激介导凋亡相关蛋白CHOP、c-caspase-12和c-caspase-3的表达水平明显升高(P值均<0.05)。结论 :雷公藤红素可诱导人骨肉瘤HOS细胞凋亡,其作用机制可能与内质网应激介导细胞凋亡通路有关。

沉默XBP1表达增强人骨肉瘤HOS细胞对MPPα-PDT疗法的敏感性

目的:研究沉默X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)表达在焦脱镁叶绿酸-α甲酯(pyropheophorbide-αmethylester,MPPα)介导的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)(MPPα-PDT)处理人骨肉瘤HOS细胞中的作用,并探讨其可能的机制。方法:MPPα-PDT作用于HOS细胞6、12和24h后,用蛋白质印迹法检测肌醇依赖酶1α(inositol-requiringenzyme1α,IRE1α)-XBP1通路中相关蛋白IRE1α和XBP1的表达水平。采用脂质体转染法将特异性针对XBP 1基因的siRNA转入HOS细胞,然后再行MPPα-PDT处理。实验分为空白对照组、siRNA-阴性对照(negative control,NC)组、siRNAXBP1组、MPPα-PDT组和MPPα-PDT+siRNA-XBP1组,分别用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测各组细胞中XBP1 mRNA和蛋白的表达水平;CCK-8法检测细胞的增殖活性;FCM法检测细胞的凋亡率,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白剪切型-caspase 3(cleaved-caspase 3)和剪切型-聚ADP-核糖聚合酶(cleaved-poly ADP-ribose polymerase,cleavedPARP)的表达水平;最后采用DCFH-DA探针染色法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量以及蛋白质印迹法检测抗氧化相关蛋白过氧化氢酶(Catalase)和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)的表达水平。结果:经MPPα-PDT诱导,HOS细胞中IRE1α和XBP1蛋白的表达水平均上调(P值均<0.05)。siRNA-XBP1可抑制HOS细胞中XBP1mRNA和蛋白的表达水平(P值均<0.01)。沉默XBP1表达可降低HOS细胞的增殖活性(P<0.05),促进细胞凋亡并上调凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3的表达水平(P<0.05),下调抗氧化相关蛋白Catalase和SOD1的表达水平(P<0.05)。与MPPα-PDT组相比,MPPα-PDT+siRNA-XBP1组细胞增殖活性降低(P<0.01),凋亡率增高(P<0.05),凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3和cleaved-PARP表达水平增高(P值均<0.05),细胞内ROS水平上调(P<0.01),抗氧化相关蛋白Catalase和SOD1的表达水平下调(P值均<0.01)。结论:MPPα-PDT可诱导HOS细胞中IRE1α-XBP1通路激活。沉默XBP1表达可抑制HOS细胞的增殖能力并提高其凋亡水平,同时增强HOS细胞对MPPα-PDT的敏感性,其机制可能与上调细胞内ROS水平以及下调抗氧化分子的表达水平相关。