牛型分枝杆菌MPB70蛋白胶乳凝集方法的建立及应用

为了研究牛结核病新型诊断试剂,提高诊断的特异性和敏感性,我们用大肠杆菌工程菌表达了牛型分枝杆菌特异性抗原MPB70并提纯蛋白建立了牛结核病乳胶凝集试验(LAT)诊断方法。MPB70是一种牛型分枝杆菌特异性分泌而卡介苗BCG缺失的蛋白质,热稳定性好,用此蛋白建立的乳胶凝集方法具有良好的敏感性、特异性以及较长的保存期,检测70份临床奶牛血清,与皮内变态反应和间接血凝方法相比较分别具有71.4%和88.6%的符合率。该方法还可鉴别诊断自然感染和疫苗免疫接种。我们建立的牛型分枝杆菌MPB70蛋白乳胶凝集试验诊断方法将分子生物学手段和经典试验方法有机结合,为临床快速检测牛结核病血清特异性抗体水平提供了行之有效的方法,。

牛IFN-γ原核表达、单克隆抗体制备及其ELISA检测方法的建立

实验旨在建立牛重组IFN-γ（BovIFN-γ）的ELISA检测技术，为牛传染病的免疫学诊断提供新方法。PHA刺激体外培养的奶牛外周血白细胞，从培养细胞中提取总RNA，经过RT-PCR扩增出BovIFN-γ基因cDNA，进一步克隆至pET28a，转化大肠杆菌，经IPTG诱导，表达出预期大小（18kD左右）组氨酸标记蛋白，经鉴定为BovIFN-γ；以纯化的重组BovIFN-γ为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得4株能稳定分泌抗BovIFN-γ单克隆抗体的细胞株，分别命名为A7、A10、G6与G10。免疫球蛋白亚类鉴定证明杂交瘤细胞所分泌的抗体均为IgG1，腹水效价在1：2^10×100～1：2^11×100之间。Western-blot分析显示，4株单抗均能特异性结合重组BovIFN-γ。ELISA试验表明，4株单抗只与融合蛋白BovIFN-γ反应，而不与非相关性蛋白Ag85B、ESAT-6-CFP-10、GM-CSF等发生反应。选取A10细胞株分泌的单克隆抗体、纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗免IgG，建立了检测BovIFN-γ的双抗体夹心ELISA方法。实验结果表明，此方法检测敏感性达到2ng／mL，特异性良好，为进一步建立灵敏、特异的病原感染诊断方法奠定了基础。

间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法的建立及初步应用

针对现行牛结核病检疫方法结核菌素皮内变态反应(TST)的不足,本研究选用牛分枝杆菌特异性抗原MPB83、MPB70及CFP10与ESAT-6融合蛋白(CFP10-ESAT-6)分别建立了检测牛分枝杆菌特异抗体的间接酶联免疫吸附方法(ELISA)。上述3种抗原中一种以上抗原的特异性抗体为阳性时,即可判断为结核检测阳性。以TST为标准,判断ELISA方法的敏感性与特异性。结果证明,ELISA方法具有较好的敏感性(71.4%)。对ELISA检测为强阳性的奶牛进行细菌分离,并对5头结核菌分离阳性奶牛进行TST检测,结果有3头为TST阳性,2头可疑,显示出ELISA方法对严重感染牛的检测较TST具有更高的敏感性。由于TST与ELISA分别以细胞免疫与体液免疫为基础,两种检测方法结合应用可进一步提高牛结核病的检出率。

重复经颅磁刺激在脑卒中康复治疗中的研究进展

据国家卫生计生委2015年最新统计数据显示,我国脑卒中已成为致死率最高的疾病,每年新发脑卒中患者多达250万。脑卒中的致残率和复发率分别为80%和41%[1]。用于治疗脑卒中后患者的康复疗法较多,主要有强制性运动疗法、运动再学习疗法、运动想象疗法等,但疗效均不十分理想[2]。

坤复康片中异泽兰黄素小肠吸收特征研究

目的研究坤复康片中的异泽兰黄素小肠吸收和坤复康片对其吸收的影响。方法Caco-2细胞模型研究不同药物浓度、pH值、温度和抑制剂对异泽兰黄素双向渗透吸收的影响。采用药动学实验研究坤复康片在体内对异泽兰黄素吸收的影响。结果数据表明,异泽兰黄素在Caco-2细胞模型中吸收较差,三种待测浓度下其吸收仅为3.27×10^(-7)cm/s至5.37×10^(-7)cm/s[从顶膜端(AP)到底膜端(BL)]和从6.27×10^(-7)cm/s至9.63×10^(-7)cm/s(从BL到AP),其转运具有pH和温度依赖性。异泽兰黄素的细胞通透性受多耐药蛋白抑制剂MK571和吲哚美辛的影响。当坤复康溶液加入后,异泽兰黄素的吸收显著性增加,从4.41×10^(-7)cm/s至6.43×10^(-7)cm/s(从AP到BL)。在药动学实验中,坤复康组的异泽兰黄素相对于单体组有更大的吸收入血暴露量。结论坤复康片中某些成分会显著促进异泽兰黄素的吸收。

绍兴市手足口病肠道病毒71型基因特征研究

目的研究绍兴市2012—2013年手足口病患者的肠道病毒71型（EV 71）病毒分离株的基因特征。方法采集手足口病患者粪便、疱疹液和咽拭子标本,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）特异性扩增进行EV 71鉴定,阳性的样本进行病毒分离,对10株分离株分A、B、C、D和E五段进行分段PCR,测序后并拼接成全长,以EV 71 A、B和C各基因型的参考毒株和以往中国EV 71的分离毒株为参考株,基于核苷酸序列和氨基酸序列对VP1区分别进行同源性分析和系统发生树构建。结果 RT-PCR结果证实分离的10株病毒均为EV 71,与C4a亚型亲缘关系最近,它们之间核苷酸和氨基酸同源性分别为95.06%-97.87%和93.60%-98.99%;与亲缘关系最远的参考毒株Cox A16的核苷酸和氨基酸同源性分别为61.17%-62.74%和68.00%-71.38%。在系统发生树上,这10株EV 71均在C基因型中,与属C4a亚型的病毒株属同一分支。结论绍兴地区手足口病患者中分离的EV 71毒株属C基因型的C4a亚型进化分支。

无偿献血者人类免疫缺陷病毒感染分析

目的了解无偿献血者人类免疫缺陷病毒（HIV）感染状况,为更好的做好献血招募工作提供理论基础。方法对2009-2013年221 715名无偿献血者抗-HIV筛查结果进行分析,对确认为阳性者的资料进行回顾性研究,数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析。结果 2009-2013年绍兴地区221 715名无偿献血者抗-HIV初筛阳性率为1.27‰,经确认为阳性的有17人,确认后阳性率7.67/10万;确认阳性者均为抗-HIV-1阳性,以未婚、19~35岁、高中/中专以下学历、初次献血、男性为主,阳性率分别为58.82%、88.24%、70.59%、70.59%、88.24%,本地户籍人口和外地户籍人口接近,以街头和站内自愿无偿献血者（64.71%）为主,可以追溯到的9名献血者均为性传播,且男男同性传播占较大比例,占44.44%。结论无偿献血者抗-HIV筛查阳性率及确认阳性率均处于较低水平,街头无偿献血的模式并不比单位团体组织采血模式更安全,献血前征询工作还需进一步加强。

坤复康片中芍药内酯苷在Caco-2细胞模型中的吸收特征研究

目的研究坤复康片中的芍药内酯苷在Caco-2细胞模型中的跨膜吸收特征,探讨人小肠对芍药内酯苷的吸收和转运。方法研究了不同药物浓度、pH值、温度和抑制剂对芍药内酯苷在Transwell细胞培养板中从顶膜(apical,AP)到基底(basolateral,BL)的双向渗透吸收的影响。结果芍药内酯苷以3种测试浓度给药时(5,20和100μmol·L^(−1)),从AP到BL方向的表观渗透系数(P_(app))值范围为(3.27~5.37)×10^(–7) cm·s^(–1)。相反,从BL到AP,P_(app)值范围为(6.64~9.63)×10^(–7) cm·s^(–1)。数据表明,芍药内酯苷转运具有pH和温度依赖性。芍药内酯苷的细胞通透性受多种抑制剂影响,包含Na^(+)/K^(+)离子通道抑制剂钒酸钠,多耐药蛋白抑制剂MK571和吲哚美辛及乳腺癌耐药蛋白抑制剂芹菜素。当坤复康溶液加入后,芍药内酯苷从AP到BL方向的P_(app)值显著增加。结论芍药内酯苷在Caco-2细胞模型中的肠道吸收较差,其吸收机制可能涉及多种蛋白介导的主动转运。

质谱法与雄激素多指标联合检测在多囊卵巢综合征诊断中的应用

目的通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对多囊卵巢综合征(PCOS)患者进行雄激素多指标的联合检测,以提升PCOS的诊断率,并探讨实现PCOS高雄激素血症(HA)早期筛查的临床意义。方法LC-MS/MS法检测85例PCOS患者及40例对照女性各雄激素指标,绘制ROC曲线,计算曲线下面积(AUC),运用联合指标提升PCOS的诊断效能,并区分PCOS高雄激素血症的不同雄激素表型;比较LC-MS/MS法与化学发光法对HA的检出率,同时比较LC-MS/MS法筛选出的HA组和非HA组内分泌及代谢异常发生率。结果睾酮(T)、游离睾酮(FT)和雄烯二酮(A4)三联指标的AUC为0.856,诊断价值高,T、A4、FT、DHEAS、DHEA五联指标AUC为0.855,诊断价值较高,LC-MS/MS法检出HA患者40例(占40.00%),显著高于化学发光法检出的25例(占29.41%)(P<0.05),而由该法筛选出的HA组内分泌及代谢异常发生率显著高于非HA组。结论LC-MS/MS法与雄激素多指标联合检测灵敏性高、准确度好,优于单指标检测,能有效提升PCOS的诊断率,实现HA的早期筛查,预防远期并发症;同时该法能识别PCOS高雄激素血症的不同雄激素表型,有利于临床实施精准治疗。