用位点特异PCR法检测Leber遗传性视神经病家系的mtDNA11778G→A点突变

目的 寻找一种快速、准确、有定量突变比例的简单PCR方法,以识别Leber遗传性视神经病(LHON)患者所携带的mtDNA 11778G→A点突变。方法 根据已知致病突变的碱基变化,设计M(突变)和N(正常)引物,分别与反向引物R配对扩增,严格控制退火温度和其他PCR反应条件达到特异扩增。病例组为LHON家系共10个个体,对照组为40位正常人。结果 在先证者、母系已发病亲属和一个10岁男孩(未发病)体内分别检出突变比例各不相同11778G→A点突变,而在家系的正常配偶、父系子女及40位正常对照组未检出该突变。结论 位点特异PCR是一种不受DNA序列有否限制性内切酶位点的检测突变的方法,适用于LHON等致病突变明确的遗传病的基因诊断。

多重实时荧光PCR相对定量法快速诊断唐氏综合征

为了建立一种基于多重实时荧光相对定量PCR技术并应用之于唐氏综合征分子诊断,选择21号染色体上唐氏综合征特异区域基因片段(DSCR3)为目的基因,以12号染色体上的磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)为参照基因,设计合成两对引物以及分别以不同荧光标记的TaqMan探针,在同一个反应管中进行扩增。以相对定量指标△CT值区分唐氏综合征患者与正常人。采用EB病毒转化技术,把唐氏综合征患者外周血B淋巴细胞转化成永生淋巴母细胞系作为标准品。通过优化反应条件,使得目的基因和参照基因的扩增效率基本一致,接近100%,模板浓度在3～300ng/μL范围内,△CT值的变异系数小于15%,浓度在30ng/μL时,变异系数最小(<10%),以该浓度的DNA作为模板进行批内和批间实验的△CT值重复性好,变异系数分别为9.8%和13.3%。运用建立的方法检测20例唐氏综合征患者的血标本和30例正常人的血标本,正常人△CT值范围是-1.90～-1.30,患者的△CT值范围是-2.95～-2.15,两组之间无交叉重叠,有明显差异(P<0.001)。唐氏综合征患者永生细胞系建系成功,染色体核型和DNA分析表明建系前后遗传是稳定的。因此,实时荧光定量PCR比较△CT值的相对定量法快速诊断唐氏综合征是可行的。

线粒体DNA A3243G点突变的临床异质性表现

目的探讨线粒体DNAA3243G点突变的临床表现特点。方法以25例临床怀疑为线粒体病,经血或肌肉线粒体DNA检查证实有A3243G点突变的线粒体脑肌病患者为研究对象,分析其临床表现、脑影像学特点、血乳酸水平和肌肉病理检查结果。结果基因检测证实25例患者均存在比例不同的线粒体DNAA3243G点突变,但临床表型有很大不同,其中19例为线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作(MELAS),2例为无法分类的线粒体脑病,2例为松软儿,1例为Kearns-Sayer综合征(KSS),1例为线粒体胃肠肌病。大部分患者脑影像学检查可见病灶,肌肉活检可见蓬毛样红纤维改变,所有患者均有血乳酸水平增高。结论线粒体DNAA3243G点突变的临床表现和脑影像学均呈高度的异质性。对表现为多系统受累的患者,如果同时合并高乳酸血症,就应考虑线粒体病的可能,应进行线粒体DNA突变的检查以明确诊断。

医学实验室十大危险操作和十项安全隐患

在实验室进行科学实验的过程中,经常遇到各种不符合规范的不良操作,有一定的危险性。此外医学实验室存在一些安全和环保上的隐患,需要引起充分重视。根据亲身经历和事故通报,总结出医学实验室最常见的操作错误和安全隐患,以便从事实验室工作的人员加以预防。

一种较为简单的用竞争性内标准作定量PCR的方法及其准确性

目的 介绍一种较为简单的定量PCR方法 ,并检测该方法的准确性。方法 以PCR引入缺失突变的方法制作竞争性DNA内标准 ,使它略小于目的DNA扩增的片段。将竞争性内标准和标本放在一管中扩增 ,以两种PCR产物之比从标准曲线求得标本中目的DNA的含量。结果 同一标本不同加样量测定大鼠肺cDNA中内皮素 - 1(ET - 1)cDNA含量 ,结果之间的最大误差为 6 .3%。重复试验测定大鼠肺cDNA中胱硫醚γ裂解酶 (CSE)cDNA含量 ,批内误差为± 7.3% ,批间误差为± 3.1- 8.5 %。结论 本法的竞争性内标准容易制作 ,定量方法较为简单 ,误差不大 ,能符合大多数检测的要求。

STK11基因多态性与家族性热性惊厥关联研究

目的 研究丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11(serine/threoninekinase 11,STK11)基因单核苷酸多态性(singlenu cleotidepolymorphisms ,SNPs)位点与家族性热性惊厥(familialfebrileconvulsions,FC)的关系。方法 用关联分析的方法,结合传递不平衡检验(transmissiondisequilibriumtest,TDT) ,对来自中国北方的家族性热性惊厥病人和对照组进行分析。结果 SNPs位点的基因型频率在惊厥患儿和对照组中分布均符合Hardy -Weinberg平衡。前期实验位点rs74 176 4的基因型频率和基因频率及rs2 0 75 6 0 4的基因型频率在两组人群中分布差异有显著性(P <0 .0 5 ) ,后期选择一般人群作为对照组进行的关联分析,除rs74 176 4基因型频率在两组间差异有显著性(P <0 .0 5 )外,其余差异均无显著性。进一步用TDT得到3个位点都没有发现传递不平衡现象。结论 STK11基因的四个SNPs位点均与家族性热性惊厥不相关,STK11基因可能不是中国北方人家族性热性惊厥的易感基因。

家族性热性惊厥与CAPS基因的相关分析

目的研究CAPS(calcyphsine)基因单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)位点与家族性热性惊厥(febrileseizures,FS)的关系。方法通过NCBI的dbSNP数据库选择CAPS基因的2个单核苷酸多态性位点,应用聚合酶链式反应—限制性内切酶长度多态性技术,检测54例家族性热性惊厥患儿和90名健康对照者的CAPS基因2个SNPs位点的基因型,用SPSS软件判定个单核苷酸多态性基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡,SNPs基因型频率和基因频率在正常人和患儿中的分布比较用R×C和2×2表χ2检验并经连续性校正。结果位点rs7249419的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡,但是它的最小等位基因频率不足1%,其基因型频率和等位基因频率在正常人和患儿间的分布无显著性差异(P>0·05)。位点rs11437855只有1种基因型,均为无插入的纯合子。结论CAPS基因SNPrs7249419、rs11437855可能与家族性热性惊厥无关。

五子衍宗液对雄性大鼠下丘脑单胺类递质、性激素和生育能力的影响

本研究观察了五子衍宗液对雄性大鼠下丘脑单胺类递质、性激素和生育能力的影响。结果表明,该方可升高老龄大鼠下丘脑去甲肾上腺素(NE)含量,降低5-羟色胺(5-HT)含量和5-HT/多巴胺(DA)比值;升高老龄大鼠血浆睾酮(T)含量,降低雌二醇(E_2)/T比值;提高雄性大鼠精子活动度、精子计数和生育能力。

五子衍宗液延缓衰老的临床研究

将60～80岁具有肾虚衰老症状的健康男性80例,随机分为五子衍宗液组及糖水安慰剂组,采用单盲法,服药5周。结果表明:五子衍宗液可使老年肾虚衰老症状的总积分值下降(P<0.01),红细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力升高(P<0.01),血浆过氧化脂质(LPO)含量下降;血浆睾酮(T)含量上升(P<0.01),雌二醇(E_2)与T比值下降(P<0.01)。而糖水安慰剂组治疗前后均无明显变化。提示减少自由基中毒损伤,增强抗氧化酶活力及调节体内性激素水平,可能是五子衍宗液治疗老年肾虚、延缓衰老的主要作用机制之一。

家族性热性惊厥患儿酪蛋白激酶γ2基因单核苷酸多态性研究

目的 研究酪蛋白激酶γ2 (caseinkinaseⅠ gamma 2 ,CSNK1G2 )基因单核苷酸多态性 (singlenucleotidepolymorphisms ,SNPs)位点与家族性热性惊厥的关系。 方法 通过NCBI的dbSNP数据库选择CSNK1G2基因的 5个单核苷酸多态性位点 ,应用聚合酶链式反应 限制性内切酶片段长度多态性技术 ,检测 5 3例家族性热性惊厥患儿和 10 1名健康对照者的CSNK1G2基因 5个SNPs位点的基因型 ,并使用EH1.2 0程序构建单体型并以单体型为标记进行进一步的患儿和正常人相关分析。结果 5个SNPs位点的基因型频率在惊厥患儿和正常人群中分布均符合Hardy Weinberg平衡。其中 3个位点SNPrs740 42 3、rs2 2 7773 7、rs10 5 9684的基因型频率和基因频率在家族性热性惊厥患儿和对照组分布差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,1个位点rs2 0 74882基因型频率和基因频率在两组人群中分布差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,另一位点rs480 682 5因基因频率较低 ,故未作统计。结论 CSNK1G2基因SNPsrs740 42 3、rs2 2 7773 7、rs10 5 9684可能与家族性热性惊厥相关。

我院科研平台之一中心实验室的建设与思考

临床医学科研水平是一流临床医学院的标志之一[1,2].近年来,我院加强了面向全院的中心实验室、实验动物中心、图书馆、医学统计室和电镜室等科研平台的建设.但是,目前临床医院在科研方面还存在很多问题.中心实验室作为设立在临床医院的研究技术平台之一,应该怎样发挥作用?是一个值得探讨的课题.

中国人非综合征性耳聋患者线粒体基因组C1494T突变筛查

目的进行非综合征性聋患者的线粒体DNA C1494T突变的分子流行病学调查。方法对中国人群中20例氨基糖甙类药物致聋患者、136例散发的非综合征性聋患者以及50例非综合征性聋家系先证者，以聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性分析法检测线粒体DNA C1494T突变的发生情况。结果全部受检者无线粒体DNA C1494T突变的发生。结论中国人群中非综合征性聋患者的线粒体DNA C1494T突变的发生率较低，且明显低于线粒体DNA A1555G的突变发生率。通过聋病分子流行病学调查，提示线粒体DNA C1494T突变不是氨基糖甙类药物致聋的主要病因。

单纯性家族性热性惊厥与HCN2基因的相关研究

目的研究HCN2基因是否为中国儿童单纯性家族性热性惊厥(FC)的易感基因。方法选择60例北方汉族单纯性家族性热性惊厥患儿,对位于染色体19p13.3区域的HCN2基因的外显子进行PCR扩增,PCR产物纯化后进行测序用以寻找可能的突变。对发现突变的区域,加入101名来自同一地区的正常人作对照。结果3～8外显子均没有发现突变,找到14个单核苷酸多态性位点(SNP),其中8个还没有报道(714T→C、723T→C、858T→C、915C→T、921C→T、963C→T、IVS4+6C→T、IVS5157G→A)。选择9个SNP作为遗传标记,进行相关分析。各SNP的等位基因频率和基因型频率在FC组(60例)和对照组(101名)之间差异无统计学意义。结论HCN2基因可能不是单纯性家族性热性惊厥的易感基因。

唐氏综合征患者永生细胞系的建立

目的建立唐氏综合征患者永生细胞系,为唐氏综合征的基因诊断提供标准品。方法采集唐氏综合征患者外周血,采用 EB 病毒转化外周血 B 淋巴细胞和加环孢霉素 A 抑制 T 淋巴细胞的技术,建立永生淋巴母细胞系。用细胞遗传学方法、实时荧光定量 PCR 及短串联重复序列(STR)多态性分析技术检测其建系前后的遗传特性及稳定性。结果建系成功,经过传代、冻存和复苏,建系后第10代染色体核型和 DNA 标志未发生改变。建系前后染色体核型均为47,XX,+21。多重荧光相对定量 PCR 鉴定,唐氏综合征患者外周血原代细胞和转化后第10代细胞株的△Ct 值均在-2.55±3s 范围内,与正常对照相比△Ct 值范围无重叠。21号染色体上的 STR 基因座 D21S11多态性分析表明,唐氏综合征患者外周血原代细胞和转化后第10代细胞株均有同样的3种基因型。结论染色体核型和 DNA 分析表明,唐氏综合征患者永生细胞系建立前后遗传特点一致,且稳定,可用作基因诊断试剂盒产品质量检测、质量控制的标准品。