TNF-α基因修饰口腔鳞癌DNL抗肿瘤的实验研究

本研究通过逆转录病毒介导TNF-α基因对口腔鳞癌引流区淋巴结淋巴细胞(DNL)进行了转导，利用PCR技术、TNF-α活性检测技术、G418培养基筛选试验，对其转导成功与否进行了分析；通过MTT比色法及基因修饰DNL杀伤Tca8113细胞的形态学观察．比较了转导及未转TNF-α基因DNL在含rIL-2培养基中的生长情况；

分化早期小儿急性白血病细胞免疫球蛋白和T细胞受体基因结构的变化

从29例免疫分型的小儿急性白血病中选出髓过氧化物酶染色阴性和不与细胞系相关或成熟细胞系相关的单克隆抗体反应的6例白血病细胞,进一步作免疫球蛋白(包括重链和κ轻链)和T细胞受体(包括δ、γ、β)基因结构的分析。所有6例均有IgH基因的重排,提示这些白血病细胞是β细胞来源。两例CD_(10)阴性和白病细胞.κ链基因没有重排,其中一例的TCRδ、γ、β基因也都处于胚系,另一例的TCRβ处于胚系。在CD_(10)阳性白血病细胞中,其中两例κ链基因丢失,TCR基因结构都有不同程度的变化(重排或丢失)。这些结果可能提示在CD_(10)阳性白血病细胞中能产生功能性IgH的重排,并可导致IgL和TCR基因结构的变化。

小儿急性白血病免疫球蛋白基因的变化

本研究分析324例小儿兔性白血病细胞的免疫球蛋白重链基因和 kappa 轻链基因的变化.结果显示:(1)免疫球蛋白基因的变化具有 B 淋巴细胞系特导性.(2)kappa 基因的重排或缺失常见于前一前B 细胞和前 B 细胞性血病.(3)急性未分化性白血病都因具有重链基因重排,提示已定向进入 B 淋巴细胞.(4)部分白血病细胞呈寡克隆性恶性增殖.(5)一例表型当前一前 B 细胞性白血病 kappa 基因重排。

PA317产生高滴度带有人TNF-α基因逆转录病毒的研究

逆转录病毒介导的基因转移技术要过渡到临床应用,主要解决如何使病毒载体具有高滴度而不具有复制活性。本文旨在探索建立一种合适的方法,能产生高滴度而且是安全的逆转录病毒载体。采用带有人肿瘤坏死因子基因的LXSN载体转染PA317包装细胞,建立产病毒的包装细胞株,结果表明:病毒载体滴度受包装培养液体积和胎牛血清浓度影响;包装细胞在32℃产生的病毒滴度比37℃高,而且比较稳定。产病毒包装细胞和被感染的靶细胞经PCR分析显示,被转染和被转导的细胞都有病毒基因的整合,而且包装细胞不会产生具有复制活性的逆转录病毒,因此能进一步用于临床研究。

核骨架基质结合区(S/MAR)提高逆转录病毒载体介导egfp在NIH3T3细胞中的表达

为减轻逆转录病毒介导的外源基因的沉默 ,进一步提高逆转录病毒MFG载体介导的转移基因的表达 ,将人 β INF基因上游 80 0bp的核骨架基质结合区 (S MAR)分别反向和正向克隆至MFG载体 3′LTR上游 ,以egfp为报告基因观察S MAR对egfp基因表达水平以及对病毒滴度的影响 .结果显示 :反向和正向的S MAR在瞬时表达的情况都不能提高egfp的表达 ,但在稳定整合的情况下反向S MAR可明显提高egfp在NIH3T3细胞内的表达 ,而正向的S MAR作用不明显 ,另外反向S MAR可明显提高MFG逆转录病毒载体的滴度约 5倍 ;因此改造后的MFG逆转录病毒载体将能更好地用来介导外源治疗基因的表达 .同时还观察到 ,同一个载体骨架在稳定表达的情况下 ,磷酸钙介导较逆转录病毒载体介导的表达水平高 .

人TNF-α基因修饰成纤维细胞的抗肿瘤研究

为了探讨人TNF-α基因修饰的成纤维细胞在体内的抗肿瘤作用,本文应用含脑心肌炎病毒(EMCV)内核糖体进入位点(IRES)的双顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TNF-α来转导TNF-α基因至小鼠成纤维细胞NIH3T3.人TNF-α基因修饰的成纤维细胞NIH3T3/TNF-α能持续高水平表达TNF-α,在小鼠肝癌H22细胞皮下植入后第3天或第7天,肿瘤部位直接注射2.5×10~5NIH3T3/TNF-α.或1×10~6NIH3T3/TNF-α能明显抑制肿瘤生长(P<0.05),增加小鼠存活率(P<0.025).可见人INF-α基因修饰的成纤维细胞有望成为一种安全、简便且有效的肿瘤生物治疗新途径.

PI3KγmRNA 3′非翻译区可能存在基因表达负调控区

为探索人磷脂酰肌醇 3 激酶γ(phosphoinositide 3 kinasePI3Kγ)基因 3′端非翻译区内AU富含区是否在基因表达调控中起作用 ,首先通过生物信息学分析发现在其 3′端非翻译区 (UTR)内存在0 9kb的AU富含区 ,其中包括 4个AU富含元件 ,以及 1个与众多基因非翻译区高度同源的长 130个碱基的区域 .将AU富含区插入报告基因egfp的下游构建pcDNA3 egfp AUR表达载体 .将表达载体转导NIH 3T3,74 0 2及K5 6 2细胞 ,流式细胞检测egfp的表达情况 .PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区可显著降低egfp的表达 2～ 3倍 (P <0 0 1) .利用放线菌素D阻断RNA转录后 ,Northern印迹分析结果显示egfp AURmRNA较egfpmRNA不稳定 .实验结果提示 ,PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区内可能存在转录后水平的基因表达负调控区 。

外源性TNF-α基因克服多药耐药性的初步研究

目的：探索外源性细胞因子 TNF-α基因克服多药耐药（ multidrug resistance,MDR）的新途径。方法：以重组逆转录病毒为载体，将 TNF-α基因导入具 MDR表型的人乳腺癌细胞系 MCF- 7/Adr，经 G418抗性筛选获阳性克隆 MCF- 7/Adr- TNF1与 MCF- 7/Adr- TNF2。以 PCR和 ELISA法检测目的基因的整合与表达。细胞计数法观察细胞生长速度的改变 , MTT法检测外源性 TNF-α基因的逆转 MDR作用，流式细胞仪分析细胞内 ADR积累的变化。结果： MCF- 7/Adr- TNF1与 MCF- 7/Adr- TNF2细胞中有 TNF-α基因的整合和表达，病毒上清中 TNF-α含量分别为 1 737 pg/ml（ 106 cells/48 h）、 2 875 pg/ml。与阴性对照细胞相比， MCF- 7/Adr- TNF1与 MCF- 7/Adr- TNF2细胞的生长速度明显减慢，生长抑制率分别为 32.4％、 54.8％，对 ADR的耐药性明显降低，耐药逆转倍数分别为 5.2倍、 19.3倍，细胞内 ADR的积累明显增加。结论：外源性 TNF-α基因的导入能有效克服耐药性，增加细胞内药物的积累为其逆转耐药性的主要机制。

外源性TNF-α基因联合异搏定、三苯氧胺逆转多药耐药性

目的 观察TNF α基因联合异搏定 (VRP)、三苯氧胺 (TAM)逆转多药耐药性 (MDR)的效果。方法 以重组逆转录病毒为载体将TNF α基因导入具MDR表型的人乳腺癌细胞系MCF7/ADR ,经G418抗性筛选获阳性克隆MCF7/ADR TNF。以PCR与ELISA法检测目的基因的整合与表达。MTT法检测外源性TNF -a基因联合VRP、TAM的逆转MDR作用 ,应用公式I=d/D1+d/D2 分析联合逆转效应。结果 MCF7/ADR -TNF细胞中有TNF α基因的整合和表达 ,TNF α分泌量为 1737pg/ml(10 6cells/ 48h)。与阴性对照细胞相比 ,MCF7/ADR -TNF细胞对ADR的耐药性明显降低 (P <0 .0 5 ) ,耐药逆转倍数为 1.6倍。TNF α基因与VRP联合呈拮抗效应 ,而TNF α基因与TAM (6 μmol/L)联合对MCF7/ADR的耐药性逆转有明显的协同效应 (效应指数I=0 .6 4)。结论 外源性TNF

多媒体在生物化学教学中的应用

目的介绍多媒体课件和网络资源进行生化的教学。方法 利用网络资源丰富教学内容并制作多媒体课件,使教学直观,易于理解。结果 多媒体课件使枯燥、深奥的内容得以形象演示,图文并茂,产生动态效果;提高了教学效果。结论 多媒体课件的使用提高了生化教学的效果,网络的发展也为生化教学提供了丰富的资源。

医学生创新能力培养的调研及分析

对上海第二医科大学九六级至○一级各专业学生进行有关创新能力的问卷调查 ,结果表明医学生对创新人才基本要素明晰 ,有较强的创新意识 ,对影响创新人才的因素较关注。当前医学教育应树立创新教育观念 ,构建综合化的课程体系 ,改进教学方法与评估体系 ,建立和完善医学生创新能力的培养模式。

H-2K^b-BSP融合基因在大肠杆菌中的表达与纯化

目的 构建可生物素化Ｈ－２Ｋ～ｂ－ ＢＳＰ融合基因的表达载体。方法 采用 ＰＣＲ技术，从 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋） Ｋ～ｂ中扩增出Ｈ－２Ｋ～ｂ基因的胞外区，拼接上依赖 ＢｉｒＡ酶的可生物素化序列后，克隆人ｐＥＴ－４２ｂ（＋）高效表达载体进行诱导表达。并对表达产物进行纯化与复性。结果 成功地构建了融合表达载体ｐＥＴ－Ｈ－２Ｋ～ｂ－ＢＳＰ，对表达产物进行纯化与复性，并应用仅识别完整构象的抗Ｋ～ｂ分子的单克隆抗体对复性后产物进行了检测。证明表达产物已部分恢复了构象。结论 获得Ｈ－２Ｋ～ｂ－ ＢＳＰ融合蛋白的高效表达，为研究在原核系统中表达、纯化与复性，以及进一步利用亲和素在体外构建ＭＨＣ－Ｉ类分子四聚体，探讨免疫识别机制奠定了基础。

HG-1/IL-2基因修饰瘤苗治疗晚期胃癌的初步临床研究(附8例报告)

目的 :评估同种异型 (HLA A2 +)IL 2基因工程化人胃癌细胞瘤苗 (HG 1/IL 2 )治疗晚期胃癌的毒副作用及临床安全性。方法 :应用基因工程技术 ,以逆转录病毒载体介导将人IL 2cDNA转导入人胃癌细胞株MKN 45 ,经10 0Gy60Co照射灭活后 ,制备成基因工程化胃癌细胞瘤苗 (HG 1/IL 2 )。 2 0 0 1年 4月～ 2 0 0 1年 7月 ,对 8例晚期胃癌病人施行HG 1/IL 2瘤苗治疗。以 5次接种为一疗程 ,接种时间分别在第 1、8、15、2 9和第 5 8天 ,每次于一侧腹股沟和对侧腋部皮下多点注射 1× 10 7个细胞。每次接种后严格观察毒副反应 ,并在治疗开始前一周和治疗结束后进行临床评估 ,同时进行凝血功能、血液生化学、肿瘤标记物及相关免疫指标检测。结果 :除 1例在第 3次接种后 ,因高热和全身性荨麻疹而终止试验外 ,余均顺利完成治疗。接种后低热和注射局部红肿、酸胀感是最常见的反应。治疗前后未观察到病人血液学、凝血功能、肝肾功能、血清标志物等指标的明显异常。部分病人治疗后血清转铁蛋白、IgG、IgA、IgM、IL 2等体液免疫指标和CD3 、CD4 、CD8等细胞免疫指标有一定程度升高。结论 :在密切观察的前提下 ,HG 1/IL

EGR-1启动子在肿瘤基因治疗中的应用

ＥＧＲ－１的启动子为早期生长反应因子－１基因上游约－５５０～０ｂｐ的一顺式作用元件，其活性受控于一些诱导剂，如电离辐射。联合ＥＧＲ－１的启动子与治疗基因（如ＴＮＦ－ａ、自杀基因），用辐射能在肿瘤局部从时、空调控治疗基因的表达，使其产物局限于肿瘤局部，并发挥放疗的杀肿瘤效应，而放疗与转基因产物又有协同作用。放射治疗与基因治疗的配伍为肿瘤的治疗提供了新思路。

PNP/fludarabine自杀基因系统对人肝癌细胞HepG2体外杀伤效应

[目的]研究嘌呤核苷酸磷酸化酶(purinenucleosidephosphorylase,PNP)/氟拉达滨(fludarabine)系统对人肝癌细胞HepG2体外杀伤效应。[方法]通过基因克隆技术将E.coliK12菌株来源的PNP基因通过8个甘氨酸的linker克隆至pEGFP鄄N1载体,在LipofectAMINE2000介导下,转染人肝癌细胞株HepG2,同时进行G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,命名为HepG2/PNP。通过PCR、RT鄄PCR、Northernblot鉴定PNP基因的表达;采用MTT和AnnexinV鄄FITC观察不同浓度的fludarabine对已转染的HepG2、不同比例转染和非转染混合细胞的杀伤作用。[结果]RT鄄PCR和Northern印迹证明转染的PNP基因能在HepG2和HepG2/PNP细胞中表达;低浓度fludarabine对转染了PNP基因的HepG2细胞具有显著的细胞毒效应;AnniexV凋亡实验结果表明PNP/fludarabine自杀基因系统对HepG2细胞具有显著的诱导凋亡作用;旁观者效应显示当10%~20%的HepG2/PNP细胞与80%~90%HepG2细胞混合在fludarabine浓度为1.0μg/ml时,可出现明显的旁观者效应。[结论]PNP/flu鄄darabine自杀基因系统在fludarabine浓度为0.5μg/ml～1.0μg/ml时对人原发性肝癌细胞HepG2具有明显的杀伤作用和旁观者效应。

脂质体介导的鼠内皮细胞抑制素基因治疗人肝癌的研究

目的 :利用内皮细胞抑制素进行肿瘤抗血管基因治疗的尝试。方法 :用RT PCR从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素cDNA ,经测序证实后 ,装入分泌表达载体pSEC hygromycin ,用DEAE 葡聚糖将其转染COS 7细胞 ,从mRNA水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达 ,并观察分泌上清是否具有特异性抑制bFGF刺激的内皮细胞增殖作用 ,并通过TDT介导的dUTP缺口末端标记法和琼脂糖电泳来探讨其作用机制。在体外利用阳离子脂质体介导分泌表达载体pSEC endo进行抗肿瘤研究。结果 :测序结果表明 ,克隆的鼠内皮细胞抑制素cDNA与文献报道的完全一致 ,RT PCR显示转染后的COS 7细胞有内皮细胞抑制素mRNA表达 ,Western blot证实转染COS 7细胞上清及包浆内均有目的蛋白表达。其分泌上清能抑制bFGF刺激的内皮细胞增殖作用 ,且这种作用是通过诱导细胞凋亡实现的 ,动物模型显示所构建分泌表达的载体能在肿瘤内表达 ,有效抑制荷瘤裸鼠人肝癌细胞周围的微血管形成及肿瘤的生长。结论

OVA_(257-264)肽-β2m融合基因的构建及体内特异性CTL的诱导

目的 构建融合基因OVA2 57 2 64 β2m的表达载体 ,并以其表达产物作为免疫原 ,在体内诱导特异性CTL。方法 采用PCR技术 ,从人肝癌细胞株SMMC 772 1中克隆人β2m基因 ,拼接上OVA(2 5 7～ 2 6 4)序列及linker后 ,克隆入pET 42b(+)高效表达载体进行诱导表达。对表达产物进行纯化与复性后 ,用其作为免疫原诱导特异性CTL ,并构建H 2Kb OVA四聚体检测特异性CTL。结果 成功地获得融合蛋白OVA2 57 2 64 β 2m及H 2Kb OVA四聚体 ,应用H 2Kb OVA四聚体对特异性CTL检测结果与经典的细胞毒试验一致。结论 OVA2 57 2 64 β 2m的表达产物 ,可有效的在体内诱导特异性CTL应答。在体外构建的MHCI类分子四聚体 。

TNF-α基因修饰的口腔鳞癌DNL生物学及免疫学特性研究

作者观察了转导及未转导ＴＮＦ－α。基因的ＤＮＬ在含ｒＩＬ－２培养基中，以及转导基因ＤＮＬ在不含ｒＩＬ－２培养基中的生长特性；并应用流式细胞仪对转导及未转导基因ＤＮＬ的ＤＮＡ指数、细胞周期、免疫表型进行了分析，结果显示：转导及未转导基因ＤＮＬ体外生长情况基本一致，转导基因ＤＮＬ在无ｒＩＬ－２培养基中无自主性生长；转导及未转导基因ＤＮＬ的ＤＮＡ指数、细胞周期时相分布及免疫表型完全一致．这一结果表明，转导ＴＮＦ－α基因对ＤＮＬ的生物学及免疫学特性无影响。