人源抗转铁蛋白受体单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:在人源单链抗体库中筛选抗人转铁蛋白受体(TfR)单链抗体(scFv)。方法:人源展示型抗体库质粒转染293T细胞,通过第一轮流式细胞分选得到比例为0.2%的阳性细胞,提取质粒并扩增,得到的质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需抗体库;第二轮分选时降低抗原浓度,最后得到2个候选的scFv序列。经序列分析,选择1号单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得单链抗体蛋白,经Forte Bio Octet进一步测定单链抗体蛋白的亲和力。结果:经过2轮筛选获得了全新的抗TfR单链抗体序列,构建并表达了该单链抗体蛋白,该单链抗体与TfR的亲和力常数为5.57×10-7。结论:从展示型人源scFv抗体库中获得了全新的抗TfR单链抗体,该单链抗体与TfR具有较好的亲和力。

人源抗BLyS单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子(BLy S)的单链抗体基因、构建表达载体并实现单链抗体的表达。方法:以哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库为起始文库,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例为0.1%的阳性细胞。从候选细胞中提取质粒并转化至DH5α中进行扩增,得到质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需的抗体库。经过依次降低抗原浓度进行了3轮分选得到2个候选的Sc Fv序列。经序列分析,选择其中一种单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得B-10 Sc Fv抗体蛋白并通过Fortie Bio Octet QK进行亲和力分析。结果:经过3轮筛选获得了全新的抗BLy S Sc Fv抗体序列,成功构建并表达了anti-Bly S Sc Fv抗体蛋白,该单链抗体与的BLy S亲和常数为3.08 nmol·L-1。结论:从哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库中成功获得了可结合BLy S的全新单链抗体基因序列,该单链抗体与BLy S具有较高的亲和力,这为后续的活性研究以及产品开发奠定了基础。

抗GPC3/NKG2D双特异性融合蛋白的制备及其功能研究

目的:构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC3)和NKG2D的双特异性融合蛋白,并初步评价其在体外对肝癌细胞的杀伤功能。方法:通过基因工程技术,将NKG2D的配体人主要组织相容性复合物Ⅰ类相关蛋白A(MHC classⅠchain-related A,MICA)胞外区融合到Fab形式的抗人GPC3抗体GC33的重链末端,构建双特异性融合蛋白(Fab GC33-MICA,FabGM)表达载体;转染FreeStyle;293-F细胞,收集细胞培养上清,经亲和纯化获得FabGM蛋白;利用分子相互作用技术(Fortebio)和流式细胞术检测FabGM的靶向亲和力;细胞实时动态成像分析系统测定FabGM介导的外周血单个核细胞(PBMCs)对高表达GPC3的人肝癌细胞HepG2的杀伤效应,ELISA法检测杀伤过程中PBMCs分泌人干扰素-γ(hIFN-γ)情况。结果:本研究成功地表达并纯化了FabGM,明确FabGM可特异性结合GPC3和NKG2D。经检测FabGM能有效介导PBMCs靶向杀伤HepG2肝癌细胞,诱导PBMCs分泌IFN-γ。结论:双特异性融合蛋白FabGM能够在体外有效介导效应细胞PBMCs杀伤肝癌细胞HepG2,为FabGM成为肝细胞肝癌的潜在靶向治疗药物提供了实验依据。