稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

双功能氧化石墨烯制备Pickering乳液用于Knoevenagel缩合

利用乙二胺(ED)对胺功能化氧化石墨烯(GO-NH_(2))表面改性得到GO-NH_(2)-ED,制备了系列Pickering乳液体系用于催化苯甲醛与丙二腈的Knoevenagel缩合反应,利用FTIR、TG、元素分析、Raman光谱等方法分析了GO-NH_(2)-ED的结构,研究了系列Pickering乳液的形貌、粒径分布及催化性能。实验结果表明,GO-NH_(2)-ED具有亲油亲水双功能,能形成尺寸小、密度大、分布窄的Pickering乳液,还能促进乳液对有机底物的吸附,乳液对Knoevenagel缩合反应的催化活性主要取决于催化体系表面的活性位点和乳液稳定性。其中,GO-NH_(2)(2)-ED(1)制备的Pickering乳液,在40℃下对苯甲醛与丙二睛Knoevenagel缩合反应的催化性能最优,苯甲醛转化率达到91%。GO-NH_(2)-ED制备的系列Pickering乳液具有良好的普适性,对芳香醛的催化活性较高,且循环使用5次后活性变化不大。

非洲猪瘟病毒多重PMA-qPCR检测方法的建立及应用

本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针,建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示,本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性,与其他常见猪病毒性原无交叉反应;同时,该方法具有较高灵敏度,p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为102copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷,本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时,PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响;对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知,两者的灵敏度均为102copies/μL;将多重PMA-qPCR方法用于23份实际样品检测,结果显示,检测活病毒的准确率为100%,说明该方法能有效区分临床样品中具有感染性的ASFV。

一株超强马立克病病毒的分离鉴定与致病性试验

从接种过马立克病CVI988/Rispens疫苗仍发生肿瘤性疾病的鸡群中分离到1株马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV),经琼脂扩散试验、病毒分离、间接免疫荧光试验、PCR鉴定和致病性试验鉴定为血清Ⅰ型MDV,命名为MDV JS201801株。该毒株基因组含2个拷贝的132 bp重复序列;meq基因的第115、139、176和217位氨基酸发生突变,与MDV强毒株的特性相符。与MDV参考毒株进行meq基因序列比对分析,发现MDV JS201801株与超强毒株ZC2014和GX0101的同源性高达99.7%。用MDV JS201801株对SPF鸡进行攻毒试验,肿瘤发生率为85%;而接种过CVI988/Rispens疫苗的SPF鸡在MDV JS201801株攻毒后的肿瘤发生率为20%。研究证明,MDV JS201801株为MDV超强毒株,并且CVI988/Rispens疫苗对该毒株不能提供足够的免疫保护。

猪流行性腹泻病毒3种结构蛋白的原核表达与免疫原性分析

根据大肠埃希菌密码子使用的偏嗜性,对G2b亚型猪流行性腹泻病毒(PEDV)JSX2014株S基因(94~525、1 306~1 641nt 2个区域)、M基因(544~669nt)和N基因(397~960nt)进行优化和基因合成,分别克隆入pET-32a(+)中,获得4种重组原核表达载体pET-Opti-S-D1、pET-Opti-S-D2、pET-Opti-M和pET-Opti-N。将重组表达载体转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定,4种重组蛋白均可获得正确表达。以表达蛋白为抗原制备的兔多抗血清,通过间接免疫荧光试验鉴定,均能与JSX2014株感染的Vero细胞发生特异性反应。进一步通过中和试验鉴定,S-D1蛋白特异性多抗血清可有效阻断JSX2014株对Vero细胞的感染。这一结果提示所表达的目的蛋白均具有良好的免疫原性,可以进一步用于G2b亚型PEDV抗体检测方法的建立。

在线式UPS逆变电路的设计

为了要解决市电中断或瞬变时对计算机等负载的连续电力供应,UPS是很有必要的,其中逆变器是UPS的核心部分。针对传统的模拟逆变电路有着不可靠、系统太过于复杂等问题,采用可控的PWM技术,给出了一种结构简单、成本较低的设计方案。在分析其工作原理的基础上,给出了逆变器的主要参数并得到了实验波形。实验结果表明,该方案可行而有效。

抗非洲猪瘟病毒药物筛选Cell-ELISA法的建立及应用

为了建立一种抗非洲猪瘟病毒(ASFV)药物高通量筛选(HTS)方法,采用ASFV感染细胞作为包被抗原,以p30单克隆抗体作为检测抗体,通过优化抗体稀释度、孵育时间等试验条件,成功建立了Cell-ELISA方法,并使用该方法对Selleck天然产物库中的1036个化合物进行了筛选。结果显示,该Cell-ELISA法筛选得到5个具有抗ASFV活性的化合物;当5个化合物浓度为10μmol/L时,PAM细胞存活率均大于80%;进一步分析ASFV p72的转录和翻译水平,结果显示,ASFV在经化合物处理的PAM上被显著抑制,确保了Cell-ELISA筛选结果的准确性。上述结果表明,该Cell-ELISA法可作为一种HTS方法,用于筛选抗ASFV药物,并促进ASFV抗病毒药物的开发,对ASF疫情防控具有重要意义。

鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株与野生株多重qPCR方法的建立

为开发一种快速、灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)野生型株与基因缺失型株的鉴别诊断方法,本研究通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-9L基因保守序列设计特异性引物和探针,并对体系进行优化,建立了一种可以同时检测p72、CD2v、MGF110-9L基因的多重q PCR方法。该方法与其他常见猪病毒性病原均无交叉反应,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对p72、CD2v和MGF110-9L重组质粒标准品的最低检出限均为102copies/mL,敏感性好;组内变异系数为0.03%~0.5%,组间变异系数为0.04%~1.5%,表明该方法重复性好。利用本方法和普通qPCR方法分别对50份临床样品进行检测,结果显示,两种检测方法对ASFV核酸的检出率均为70%(35/50),符合率为100%。综上所述,本研究建立的多重qPCR方法为临床鉴别检测ASFV野毒株与基因缺失株提供了重要材料。

猪德尔塔冠状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

通过DNAStar Protean软件对猪德尔塔冠状病毒(porcine Deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较强的区段(265~342 aa),根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性进行优化设计并人工合成了对应的基因片段N-Opti。利用融合表达载体pET-32a进行原核表达,获得的融合蛋白携带His标签,命名为PDCoV-N-His,且呈可溶性表达。Western blot鉴定结果显示,该重组N蛋白约为31 kDa,与预期相符。利用Ni-NTA亲和层析介质纯化重组N蛋白作为包被抗原进行ELISA检测,并对反应条件进行摸索、优化,建立了检测PDCoV特异性抗体的间接ELISA方法。经测定,该方法具有良好的特异性且重复性良好,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRoV)特异性阳性血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。应用该方法对20份已知阳性血清和20份阴性血清分别进行检测,结果显示阳性符合率为100%(20/20),阴性符合率为100%(20/20)。结果表明,该方法的特异性良好,可以进一步用于PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查。

芬母多肽对弧菌的杀菌效果及其对罗氏沼虾的安全性测定

为检测芬母多肽的杀菌效果并研究其在罗氏沼虾养殖中的应用,测定了芬母多肽对多种致病性弧菌的杀菌率和最小抑菌浓度(MIC),以及不同浓度芬母多肽对罗氏沼虾幼体、成虾安全性和水质的影响。结果显示:芬母多肽对河流弧菌、霍乱弧菌和溶藻弧菌的杀菌效果较好,对副溶血弧菌的杀菌效果较差;对梅氏弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌的最小抑菌浓度分别为1、0.25和0.25 mg/mL;将芬母多肽投放到养殖用人工海水中,当浓度为0.004 mg/mL时能够杀灭0 d养殖用人工海水中50%左右的细菌,幼体的死亡数显著降低(P<0.05),随着浓度不断增高,养殖用人工海水亚硝酸盐氮和氨氮的含量显著增高(P<0.05),使幼体的死亡数显著增高(P<0.05);芬母多肽对罗氏沼虾成虾的安全浓度为0.05 mg/mL。研究表明,芬母多肽在水产养殖中有广阔的应用前景。

非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L(P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法灵敏度相当,低至10 copies,μL,检测时长仅需10 min,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应。对100份临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR结果一致,但相较于荧光定量PCR检测时间的2h,检测时间大大缩短。结果表明,本研究建立的方法灵敏度较高、特异性较好,为ASFV早期临床诊断提供了技术支持。

塞内卡病毒A VP1蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备与初步应用

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)感染猪可引起口鼻、蹄和冠状动脉带等部位出现水疱,严重危害猪的健康。VP1蛋白是SVA重要的结构蛋白,含有病毒主要的抗原表位并可诱导猪产生中和抗体。本研究采用原核表达系统,将VP1基因分别克隆入表达载体pET32a和pGEX6P1中构建重组质粒,通过优化诱导表达条件,利用亲和层析介质纯化,成功制备了重组蛋白VP1-His和VP1-GST。以纯化的VP1-His蛋白免疫BALB/c小鼠,以纯化的VP1-GST蛋白建立间接ELISA,成功筛选获得3株稳定分泌抗VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A2、5D12和6G10,经Western-blot及间接ELISA鉴定,3株单克隆抗体具有良好的特异性,其腹水效价分别为1∶51200、1∶25600、1∶12800。应用效价最高的3A2抗体初步建立了检测猪血清中抗SVA抗体的竞争ELISA。临床样品检测结果表明,建立的竞争ELISA具有高敏感性,高特异性和高准确性。VP1蛋白单克隆抗体的制备为SVA致病机制的研究提供了材料支撑;竞争ELISA的建立对于SVA感染的防控具有重要意义。