颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定。方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性。结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a(+)中,构建了表达质粒pET28a(+)-GNLY。经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性。结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础。

实时荧光定量PCR检测结直肠腺癌患者组织中广泛型线粒体肌酸激酶基因的表达

目的建立检测人广泛型线粒体肌酸激酶（ubiquitous mitochondrial creatine kinase，uMtCk）mRNA荧光定量的方法，并检测了结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织中uMtCk基因表达的水平。方法基于TaqMan荧光探针技术，以GAPDH作为内参，建立实时荧光定量RT-PCR方法，并检测了30名结直肠腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织uMtCk mRNA的表达。结果30倒结直肠肿瘤患者肿瘤组织中有uMtCk mRNA的表达，范围为7.4×10^5－5.3×10^8拷见／μg RNA，均值为（9.4±5.7）×10^6拷贝／μg RNA；30例癌旁组织uMtCk表达为4.5×10^3－6.9×10^5拷贝／μg RNA，均值为（8.6±3.4）×10^4拷贝／μg RNA。结论成功地建立了人uMtCk基因表达含量的荧光定量检测方法，检测结果可用绝对拷贝数表示，定量准确可靠。且结直肠腺癌病人肿瘤组织uMtCk mRNA的含量是升高的，提示uMtCk mRNA含量的检测有助于结直肠腺癌病人临床诊断。

荧光定量RT-PCR测定人颗粒溶素基因表达水平

目的:通过建立荧光定量RT-PCR的方法,检测颗粒溶素(Granulysin,GNLY)mRNA在人外周血单个核细胞(PBMCs)中基因表达的水平。方法:基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T-GNLY,建立荧光定量RT-PCR方法,并检测了40名正常健康献血者外周血中GNLY的表达水平。结果:内参18SrRNA的动态检测范围为103～108拷贝/μgRNA;而40名正常健康人外周血的PBMCs中均有GNLYmRNA的表达,范围为3.12×106～4.32×107拷贝/μgRNA,均值为[(2.0±1.3)×107]拷贝/μgRNA。结论:建立了人GNLY基因表达水平的荧光定量PCR检测方法,结果准确可靠,为今后进一步研究GNLYmRNA表达水平与感染性疾病免疫机制的相关性研究打下了基础。

颗粒溶素在原发性胆汁性肝硬化患者外周血中的表达及临床意义

目的:探讨颗粒溶素(granulysin,GNLY)在原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血中的表达及其与PBC发生发展的关系。方法:实时荧光定量RT-PCR(FQ-PCR)方法检测60例PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)中GNLY mRNA的表达,并以健康人群(n=60)和乙型肝炎后肝硬化患者(n=60)作为对照。ELISA法检测各组研究对象血清中GNLY蛋白水平,并比较不同疾病分期PBC患者的表达差异。应用统计学软件分析PBC患者血清GNLY蛋白水平与GNLY mRNA表达、疾病分期及肝功能指标间的相关性。结果:PBC患者外周血GNLY mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照[(2.7±2.5)×108vs(3.0±1.9)×107,P<0.01]和乙型肝炎后肝硬化患者[(4.7±3.6)×105,P<0.001]。PBC患者血清中的GNLY蛋白水平(ng/ml)显著高于健康对照(15.48±3.24vs4.76±2.32,P<0.01)和乙型肝炎后肝硬化患者(2.57±1.84,P<0.01)。血清中GNLY蛋白水平在早期和晚期PBC患者之间差异显著(P<0.01)。PBC患者血清中GNLY蛋白水平与GNLY mRNA表达呈正相关,与血清GGT、ALP的浓度呈正相关(P<0.01)。结论:PBC患者PBMC中GNLY mRNA表达和血清中GNLY蛋白含量显著高于健康人群及乙型肝炎后肝硬化患者;血清GNLY蛋白水平与PBC的发生发展存在一定的关联性,对其的检测有助于临床对PBC病情的监控。

颗粒溶素重组表达载体的构建和原核表达

目的:构建人颗粒溶素(Granulysin,GNLY)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:抽提体外培养的单个核细胞总RNA,通过RT-PCR的方法获得含有222bp的颗粒溶素cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达并经Ni亲和层析纯化。用SDS-PAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GNLY融合蛋白的生物学活性。结果:酶切结果证实,成功地构建了GN-LY原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致。结论:成功构建了重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达,获得了具有良好的抗原性和特异性的GNLY融合蛋白,为下一步研究人GNLY的功能奠定了基础。

定量RT-PCR检测PBC患者外周血中颗粒溶素的基因表达水平

目的建立检测人颗粒溶素(granulysin,GNLY)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR的方法,并测定PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)中GNLY的基因表达水平,探讨GNLY基因表达水平与原发性胆汁性肝硬化(PBC,primarybiliary cirrhosis)发生发展的关系。方法基于TaqMan荧光探针技术,构建质粒pET28a-GNLY,作为定量模板,建立实时荧光定量RT-PCR方法。用此方法测定了60例PBC、60例乙型肝炎肝硬化及60例健康对照者外周血中GNLY mRNA的含量。结果PBC患者GNLY mRNA的表达范围为5.35×107-4.61×109拷贝/μg RNA;健康对照者为9.28×105-7.32×107拷贝/μg RNA。PBC组GNLY mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组(P<0.01)和疾病对照乙型肝炎肝硬化组(P<0.001)。结论成功建立了人GNLY基因表达含量的荧光定量检测方法,PBC患者GNLY mRNA的含量显著高于健康对照组,GNLY表达与PBC的发生发展存在一定的关联性。

高渗/高胶液与休克复苏

临床中通常使用等渗晶体、胶体或成份血作为休克复苏液 ,但鉴于这些液体在复苏中的不力表现 ,寻找一种全新的复苏液成为当务之急。近年来高渗 /高胶液在临床应用中以取得满意效果并展现出良好前景。笔者就高渗 /高胶液复苏机制 ,对机体的影响及使用中的问题做一综述。

miRNA与固有免疫

miRNA是近年来发现的一种小分子RNA,参与细胞分化、生长发育等多种生物学过程,与人类疾病密切相关。最近,有研究发现miRNA可以通过TLR的信号转导途径和细胞因子反应参与固有免疫。本文对miRNA和RNA干扰在固有免疫反应中的调控作用作一综述。

择期腹部手术术后脑血管意外5例报告

本文回顾性分析 5例择期腹部手术术后脑血管意外的临床资料 ,探讨其病因及诊治方法。 5例患者于术后 4h至 2d发生脑血管意外 ,均经CT证实。患者接受保守治疗 2～ 1 2 7d。最终 3例死亡 ,2例病情稳定后出院。

大鼠失血性休克及复苏后肝脏EPHX2和Sp1基因表达的变化

目的观察失血性休克及复苏对大鼠肝脏EPHX2基因及预测转录因子Sp1表达的影响。方法通过软件预测EPHX2转录因子,筛选出Sp1为研究对象。将25只SD大鼠随机平均分为5组:对照(CON)组、失血性休克(HS)组、休克复苏1 h(HSR1)组、休克复苏3 h(HSR3)组、休克复苏6 h(HSR6)组。采用real-time RT-PCR和蛋白质印迹法检测大鼠肝脏中EPHX2和Sp1的表达。结果HS、HSR1、HSR3、HSR6组EPHX2 mRNA表达低于对CON组(P<0.05),HSR1、HSR3、HSR6组EPHX2 mRNA表达低于HS组(P<0.05),HSR1组EPHX2 mRNA表达低于HSR3、HSR6组(P<0.05)。CON组Sp1mRNA表达和其他组比较差异无统计学意义(P>0.05),HS、HSR1组Sp1 mRNA表达低于HSR6组(P<0.05)。HSR1、HSR3、HSR6组EPHX2蛋白表达较CON组降低(P<0.05),Sp1蛋白在各组间表达差异无统计学意义。结论失血性休克可引起肝脏EPHX2基因表达下调,而复苏不能快速逆转这种趋势;失血性休克及复苏对预测转录因子Sp1表达没有影响。

人颗粒溶素的克隆、原核表达及其抗体制备

目的构建人颗粒溶素(GNLY)质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2(IL-2)刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+)中,得到重组质粒pET28a(+)-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍(Ni)亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Westernblot)进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a(+)-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞活性的研究打下了基础。

急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞颗粒溶素mRNA定量测定及临床意义

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测乙型肝炎(简称乙肝)患者外周血单个核细胞(PBMC)中颗粒溶素(GNLY)mRNA的表达,探讨GNLY基因表达水平与急性乙肝的关系。方法实时荧光定量RT-PCR分别检测40例急性乙肝患者及100名正常对照的PBMC的GNLY基因表达水平,同时检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。结果急性乙肝患者发病期mRNA表达显著高于正常对照组(P<0.01),恢复期GNLY基因表达与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。乙肝患者GNLYmRNA与血清ALT、AST呈正相关。结论实时荧光定量RT-PCR检测GNLY mRNA的表达准确可靠。患者外周血GNLY基因表达水平与急性乙肝的发生发展存在一定的相关性。

应用非吸收生物材料行腹股沟疝修补术对糖尿病患者切口愈合的影响

采用非吸收生物材料对 37例合并糖尿病 (糖尿病组 )和 40例未合并糖尿病患者 (对照组 )行腹股沟疝修补术。观察非吸收生物材料腹股沟疝修补术对合并糖尿病患者切口愈合的影响。两组均行择期手术 ,糖尿病组术后发生切口感染 2例 ,其中 1例发展为腹股沟脓肿并导致近期复发 ,对照组发生切口感染 2例。资料显示 :合并糖尿病的腹股沟疝患者通过围手术期血糖的控制 ,接受非吸收生物材料腹股沟疝修补术可以取得满意的治疗效果。

Ⅰ型变态反应生物学治疗的研究进展

Ⅰ型变态反应生物学治疗已得到全世界的广泛关注,其研究近期也有了长足进展。现主要从特异性和非特异性治疗两大方面就其发展进行总结、归纳,对Ⅰ型变态反应病的临床治疗有一定的参考价值。

人TACI-linker-BR3双受体融合基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建人双受体融合基因真核表达载体———pcDNA3.1(+)-TACI-linker-BR3-IgGFc,观察其在COS-7细胞中的表达。方法:应用基因工程技术构建重组载体,脂质体转染COS-7细胞,通过Western印迹、ELISA以及免疫组化方法,检测目的蛋白的表达及其与BAFF、APRIL蛋白相互作用情况。结果:融合基因在瞬时转染的真核细胞中获得表达,并分泌至上清,转染效率能达到48%,融合蛋白能与BAFF、APRIL蛋白有效结合而且融合蛋白中分子标签IgGFc未影响双受体融合蛋白的结构及其生物学活性。结论:人TACI-linker-BR3双受体基因与IgGFc融合基因载体构建成功,表达的融合蛋白具有生物学活性,为进一步探讨SLE等自身免疫疾病的发病机制和生物学治疗方法奠定了基础。

低剂量颗粒溶素对单核细胞和T细胞具有趋化作用

目的探讨低剂量颗粒溶素(GNLY)对免疫细胞的趋化作用。方法抽取健康人全血,分离出外周血单个核细胞(PBMC),经免疫磁珠法纯化出单核细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD45RA+T细胞、CD4+/CD45RO+T细胞、CD8+/CD45RA+T细胞和CD8+/CD45RO+T细胞,再用96孔微孔趋化板进行趋化反应。结果颗粒溶素可趋化一些T细胞系、单核细胞系,趋化指数≥2(P<0.05),而对B细胞系的趋化指数为<2。用百日咳毒素预处理过的T细胞系、单核细胞系不再对颗粒溶素有反应,提示颗粒溶素介导的趋化作用涉及G蛋白偶连受体。结论颗粒溶素不仅是一种细胞毒性分子,而且具有化学趋化作用。颗粒溶素在10～100μmol发挥细胞毒活性而在相对较低的浓度下发挥趋化作用且此效应涉及G蛋白偶连受体。

复方高渗盐溶液对失血性休克大鼠脾脏细胞凋亡的影响

目的探讨复方高渗盐溶液(高渗氯化钠羟乙基淀粉40注射液,HSH)对失血性休克大鼠脾脏细胞凋亡的影响。方法采用SD大鼠失血性休克模型,分别用HSH或乳酸林格氏液(RL)复苏,复苏后1、2、4小时处死动物,使用HE染色、透射电镜及TUNEL法观察其脾脏中淋巴细胞凋亡情况。结果RL组复苏后1小时、HSH组各时相点凋亡指数(AI)与假手术组比较无明显差异(P>0.05)。HSH组各时相点AI无明显差异(P>0.05)。RL复苏组除复苏后1小时外,AI均明显高于HSH组(P<0.05)。结论HSH能减少失血性休克诱导的脾脏淋巴细胞过度凋亡,对失血性休克后机体免疫功能紊乱起保护作用。

颗粒溶素对U937细胞分泌MCP-1、RANTES与TNF-α功能的影响

目的探讨颗粒溶素对U937细胞分泌MCP-1、RANTES与TNF-α功能的影响。方法①在U937细胞中加入终浓度为100ng/ml的乙酰肉豆蔻佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA),刺激2d后,再加入不同组合的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、葡萄球菌的脂膜酸(lipoteichoic acid,LTA)、颗粒溶素(granulysin,GNLY),刺激培养4h后收集细胞上清,用ELISA检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的含量。②在U937细胞或原代单核细胞中加入GNLY后,在37℃条件下,刺激4h,收集上清,以ELISA分析MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1,单核细胞趋化因子-1)和RANTES(reduced upon activation normal Texpression and secreted,正常T细胞活化时表达和分泌减少因子)的含量;收集细胞并抽提总RNA后,以实时荧光定量RT-PCR方法检测部分基因表达水平的改变。结果加入GNLY后,LPS诱导U937细胞分泌的TNF-α水平显著增加(P<0.05);U937细胞或单核细胞的MCP-1、RANTES的mRNA水平显著增加(P<0.05),上清液中MCP-1和RANTES水平也增加(P<0.05)。结论GNLY可促进LPS诱导单核细胞分泌TNF-α,本身可刺激单核细胞表达MCP-1、RANTES增高,这为以后进一步研究颗粒溶素的作用机制打下了基础。

血管黏附蛋白1在大鼠重症失血性休克中的表达

目的观察重症失血性休克及复苏过程中大鼠小肠及血清中血管黏附蛋白1(VAP-1)的表达和活性变化,探讨抑制其功能对休克预后的影响。方法将实验大鼠随机分为假手术组、休克组、休克复苏组、复苏对照组和复苏实验组,每组10只。建立重症失血性休克及复苏大鼠模型,采用蛋白质印迹和real-time RT-PCR法检测假手术组、休克组、休克复苏组休克前、休克1h、复苏1h时小肠组织中VAP-1表达及其编码基因含量,ELISA法检测血清中VAP-1含量及其活性。复苏实验组加用20mg/kg 2-溴乙胺,复苏对照组加用1mL/kg生理盐水,比较两组复苏后的血压、复苏24h后小肠黏膜损伤情况(Chiu’s评分)和小肠黏膜上皮细胞凋亡情况(TUNEL),并比较大鼠24h生存率。结果重症失血性休克组大鼠小肠组织VAP-1蛋白水平以及其编码基因mRNA水平、血清中VAP-1含量及其活性均较假手术组升高(均P<0.05),复苏后上述各值均有所下降,但仍高于假手术组。相对于生理盐水对照组,休克复苏后1h和24h使用20mg/kg 2-溴乙胺的复苏实验组大鼠血压升高(P值分别为0.010和0.039),且复苏实验组Chiu’s评分及肠黏膜上皮细胞凋亡指数均低于生理盐水复苏对照组(P值分别为0.022和0.002),休克大鼠24h生存率也高于复苏对照组(90%vs 60%)。结论重症失血性休克能使大鼠VAP-1的表达、活性增高,而液体复苏能减轻这种增高;抑制其活性能改善重症失血性休克及复苏后的低血压以及小肠黏膜的损伤和细胞凋亡,提高大鼠24h生存率。