基于二聚体核衣壳蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体iELISA检测方法建立

为制备稳定性好、免疫反应性佳的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N),设计表达二聚体N蛋白(N-dimer),并基于该蛋白质建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体间接酶联免疫吸附试验(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)检测方法。首先选取当前PRRSV国内优势毒株NADC30-like N蛋白基因序列,通过(GGGGS)3linker将N蛋白基因序列串联,经密码子优化合成后构建N-dimer重组表达载体。利用原核表达系统进行诱导表达,并通过镍离子螯合亲和层析法进行纯化。Western-blot分析其与PRRSV阳性和阴性血清的反应性;冻融法比较N-dimer与单体N蛋白(N-monomer)的沉淀析出情况;ELISA法比较N-dimer与N-monomer的免疫反应性。以N-dimer作为包被抗原建立PRRSV抗体iELISA检测方法,对该方法的反应条件进行优化,验证其特异性、敏感性、重复性,并应用于临床血清样品检测。结果表明,在16℃、0.2 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷条件下诱导16 h,N-dimer获得大量可溶性表达。Western-blot结果表明,N-dimer能够与PRRSV阳性血清发生特异性反应;相较于N-monomer,N-dimer能够稳定保存,并且免疫反应性更佳。成功建立了基于N-dimer的PRRSV抗体iELISA检测方法,且该方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性;与商业试剂盒结果进行比较,其阳性符合率为96.88%,总符合率为96.86%,符合率高。综上,成功制备了稳定性好、免疫反应性佳的N-dimer,并基于N-dimer建立了PRRSV抗体iELISA检测方法。

虾源副溶血性弧菌PirB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

用杆状病毒表达系统表达虾源副溶血性弧菌编码蛋白PirB的重组蛋白,用SDS-PAGE、Western blot对其进行鉴定,纯化后的PirB重组蛋白免疫Balb/c小鼠后进行细胞融合,通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,用ELISA方法对单克隆抗体进行测定。结果发现,共筛选到7株能够稳定分泌抗PirB蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,小鼠腹水的效价最高效价达到1∶2.56×10^(6),制备的单克隆抗体可以特异性识别PirB蛋白,表明成功制备了虾源副溶血性弧菌PirB蛋白单克隆抗体,为虾源副溶血性弧菌引发的疾病诊断奠定了基础。

云南省部分地区规模猪场猪伪狂犬病流行病学调查

为调查云南省规模化猪场猪伪狂犬病流行情况,2016—2017年分别采用ELISA和PCR检测技术,对从云南省9个地区54个猪场采集的6 555份全血和381份疑似病料进行了血清学和病原学检测。抗体检测结果显示:血清样品的gB抗体阳性率为88.7%,gE抗体阳性率为13.5%;楚雄市的gB抗体阳性率最低(78.5%),但gE抗体阳性率(野毒感染率)最高(21.8%);大理市的gB抗体阳性率最高(95.1%),但野毒感染率最低(6.0%);第2季度野毒感染率最高,为20.3%。病原学检测结果显示:疑似病料病原检测平均阳性率为23.1%,其中母猪、保育猪和育肥猪分别为28.8%、23.4%和20.4%,公猪精液为25.0%,流产胎儿和仔猪为22.3%;玉溪市的病原检出率最高(52.6%),德宏市最低(16.4%);各季度的病原检出率无明显差异。调查结果表明,猪伪狂犬病在云南省仍有流行,部分地区较为严重,尤其是玉溪、宣威和西双版纳等地区;应重点加强对母猪、保育猪、仔猪以及公猪精液的防控;加强伪狂犬病免疫,提高gB抗体阳性率,有助于预防野毒感染。

10株猪流行性腹泻病毒云南分离株的S基因克隆及分子特征

自2013年来,猪流行性腹泻病(PED)的暴发给云南省养猪业带来严重的经济损失。本研究对2018年来自云南4个地区的42份病料中分离出的6株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的部分S基因进行扩增,并结合在2013年所分离到的来自云南4个地区的4株PEDV流行株,进行分子特征和遗传进化分析。结果显示:这2年的分离株和CV777株相比,2018年分离株的核苷酸和氨基酸突变位点增加了12个和7个,且有3个丝氨酸突变都是在COE结构域(69、101和146)。系统发育分析表明,2018和2013年分离株的核苷酸和氨基酸的同源性为95.6%～98.8%,95%～98.8%;分别与CV777株相比,核苷酸和氨基酸的同源性差异较小(94.9%～95.5%和92.7%～95.4%;94.5%～95.2%和93.4%～94.2%),亲缘关系都较远。2013年的分离株主要分布在G2b亚群,而2018年的分离株主要分布在G2a和G2c亚群,具有遗传多样性。N-糖基化和磷酸化位点预测分析显示,在216位上预测的N-糖基化位点由NSSI→NSSF,尤其是COE结构域中的丝氨酸取代而导致其可预测磷酸化。这些变异很可能会影响其抗原性和疫苗效果,导致PEDV控制效果不好。本研究阐明了云南部分地区PEDV流行毒株的分子流行病学和遗传特征,为该地区PED的防控奠定理论基础。