割手密SnRK2基因家族全基因组鉴定及干旱胁迫表达分析

【目的】探究割手密SnRK2基因家族成员在干旱胁迫中的调控机制,为抗旱性甘蔗品种的选育提供侯选基因。【方法】以全基因组数据为基础从割手密中鉴定SnRK2基因,并对其进行生物信息学分析和干旱胁迫下的表达分析。【结果】在割手密基因组中共鉴定出11个SnRK2基因家族成员,命名为SsSnRK2.1-SsSnRK2.11,且这些基因不均匀地分布于8条染色体上。SnRK2蛋白的氨基酸残基数为227~580,分子质量为25683.53~64695.8 kD,等电点为4.62~8.94,且均为亲水性蛋白。系统发育树可将其分为3个亚组,且同亚组中的保守基序基本相似,外显子数量以7~9个为主。SsSnRK2基因家族成员的启动子中含有多种激素类和逆境胁迫响应类的作用元件。割手密SsSnRK2基因家族成员的表达具有组织特异性。所有的SsSnRK2基因均能不同程度地响应干旱胁迫。【结论】割手密SnRK2基因家族在响应干旱胁迫过程中发挥重要作用,可为割手密的抗逆性研究提供一定的理论依据。

低温胁迫下不同甘蔗品种的生理响应及耐寒性评价

低温是影响甘蔗生长发育、产量以及分布的主要环境因子之一。探究甘蔗在低温逆境下的生理反应特性,筛选强耐寒性甘蔗亲本材料,对指导甘蔗育种及推动甘蔗产业发展有重要的意义。本研究以8份不同甘蔗品种及1份甘蔗近缘野生种(蔗茅99-1无性系)为试验材料,研究其在低温胁迫处理后的生理指标响应,并利用主成分分析、模糊隶属函数法和聚类分析对9份材料的耐寒性进行综合评价。研究结果显示:经低温胁迫处理(3℃,3 d)后,绝大部分材料的丙二醛(MDA)、叶绿素(Chl)、可溶性糖(SS)以及可溶性蛋白(SP)含量较CK升高;所有材料的脯氨酸(Pro)含量均较CK升高,而超氧化物歧化酶(SOD)活性均较CK降低;此外,绝大部分材料的过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性也较CK升高。并且发现强耐寒性的材料(蔗茅99-1、崖城89-9、ROC10)经低温胁迫处理后能够维持较低的MDA含量,和较高的SS、SP、Pro含量以及POD、CAT活性。结合综合评价值(D),通过聚类分析将9份材料的耐寒能力分别划分为强耐寒类型(蔗茅99-1、崖城89-9、ROC10)、中度耐寒类型(ROC20、粤糖93-159、黄加利、ROC16)和弱耐寒类型(滇蔗01-58、ROC22)3个类群。这些结果表明,不同甘蔗品种对低温的适应能力不同,强耐寒性甘蔗品种在逆境下能够迅速通过自身调节,合理提高渗透调节物质含量及抗氧化酶活性,进一步清除体内的活性氧(ROS)等有害物质,平衡细胞代谢过程,从而更好地适应低温环境。本研究为探明甘蔗低温胁迫应答调控机理,选育强耐寒性甘蔗新品种奠定基础。

30份割手密种质资源苗期抗旱性综合评价

【目的】依据生理生化指标综合评价不同基因型割手密种质资源的苗期抗旱性,为甘蔗抗旱性育种的亲本选育提供参考。【方法】以30份割手密野生种质为试验材料进行盆栽试验,测定割手密苗期干旱胁迫处理前后的6项生理生化指标,采用主成分分析、模糊隶属函数分析和聚类分析对割手密的抗旱性进行综合评价。【结果】与正常供水相比,干旱胁迫下各割手密种质材料的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性增强,丙二醛(MDA)、可溶性糖(SS)、脯氨酸(Pro)含量增加,但各指标的变化程度因材料不同而存在一定差异。相关性分析结果表明,在干旱胁迫下,不同割手密种质材料叶片的过氧化氢酶活性和脯氨酸含量之间呈显著正相关(P<0.05),超氧化物歧化酶活性和脯氨酸之间呈极显著正相关(P<0.01);过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性之间呈显著负相关;过氧化氢酶活性与丙二醛含量之间也呈显著负相关,其他指标之间无显著相关性(P>0.05)。主成分分析表明,SOD活性、POD活性、CAT活性和Pro含量、SS含量、MDA含量可作为割手密抗旱性评价的重要指标。通过模糊隶属函数分析和聚类分析可将30份割手密种质材料划分为4类,其中高度抗旱材料1份(90⁃53),中高度抗旱材料2份,中度抗旱材料14份,低度抗旱材料13份。【结论】CAT活性、SOD活性、POD活性、MDA含量、SS含量、Pro含量可作为割手密苗期的抗旱性评价指标。30份参试割手密种质中,90⁃53的抗旱性最强,2015⁃22、88⁃301次之,2015⁃104的抗旱性最弱。

DREB转录因子研究进展及其在甘蔗抗逆育种中的应用

DREB家族基因是植物特有的转录因子,具有耐寒、耐旱和耐盐胁迫等优异的功能。DREB基因家族庞大且具有相似的保守AP2结构域。不同植物,不同亚组的DREB基因具有不同的功能。本文综述了DREB基因家族的结构、分类,在低温、干旱、高盐、重金属和病害的逆境胁迫下参与的信号通路和功能,以及目前在甘蔗及其近缘野生种中的研究现状。同时,也为在蔗茅野生种中开展DREB家族基因的研究及最终运用到抗逆转基因甘蔗的培育上做出了相应的思考和展望。

蔗茅EfMYB1基因的克隆与表达分析

为了充分利用蔗茅(Erianthus fulvus)野生资源,挖掘其优良的抗性基因,丰富转基因甘蔗育种候选基因库,该研究结合蔗茅转录组数据,以蔗茅99-1无性系为试验材料,利用RT-PCR技术克隆蔗茅MYB基因,并对其进行生物信息学分析及胁迫表达分析,以解析蔗茅的耐寒机理,为转基因甘蔗育种奠定理论基础。结果表明:(1)成功克隆得到一个蔗茅MYB基因,命名为EfMYB1基因(登录号ON586646)。(2)生物信息学分析表明,EfMYB1基因全长1000 bp,ORF为759 bp,编码251个氨基酸;编码蛋白具有一个保守的SANT结构域,无跨膜结构和信号肽,有多个磷酸化位点;二级结构与三级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主;与南荻相似性最高,遗传距离最近。(3)qRT-PCR分析结果发现,EfMYB1基因在蔗茅根和叶组织中的相对表达量随低温胁迫时间的持续而逐渐显著上调,并于胁迫72 h时达到最大值,而在茎中的表达则几乎没有变化;茉莉酸甲酯胁迫下,EfMYB1基因的相对表达量呈先升高后降低的趋势,且在处理6 h时达到最高值;脱落酸胁迫下EfMYB1基因的表达水平较0 h时极显著降低。研究认为,EfMYB1基因属于低温胁迫响应基因,可能参与蔗茅低温胁迫下的应答反应。

割手密干旱响应NAC转录因子的克隆及表达分析

NAC转录因子参与植物对生物和非生物胁迫响应过程。本研究以甘蔗野生种割手密为材料,克隆得到3个SsNACs基因,命名SsNAC2、SsNAC3、SsNAC4。生物信息学分析表明,其编码序列CDS全长931 bp、486 bp、781 bp,编码309个、162个、259个氨基酸。亚细胞定位预测3个SsNACs基因位于细胞核,上游启动子含有与逆境胁迫应激相关的ABRE、LTR、MBS、MYB、STRE顺式作用元件。系统进化分析表明SsNAC2与高粱SbNAC68亲缘关系最近,属于OsNAC3亚家族,SsNAC3与南荻MlNAC1亲缘关系最近,属于ATAF亚家族,SsNAC4与高粱SbNAC82同属NAC2亚家族。组织特异性表达分析结果SsNAC2、SsNAC3基因在割手密茎叶生长期表达量较高。基因表达谱分析表明,不同胁迫下3个SsNACs基因的相对表达水平不同,推测SsNAC2、SsNAC3和SsNAC4基因可能参与调控割手密应对干旱、低温、盐分、病原真菌等非生物和生物胁迫,同时又能够被ABA和MeJA诱导表达,以上研究为进一步分析NAC转录因子在割手密响应逆境胁迫中的功能奠定理论基础。

接种内生菌对干旱胁迫下甘蔗的生理影响

探索内生菌对甘蔗抗旱能力的影响,以期为开发利用甘蔗内生菌抗旱性功能菌株提供理论依据和技术支撑。以课题组前期分离鉴定的6株甘蔗内生菌为供试菌株,甘蔗品种‘ROC22’幼苗接种7天后进行干旱胁迫,然后取完全展开的第一叶叶片测定相关生理指标。结果表明,E3、O9和YC89均有较高的ACC脱氨酶活性,不同甘蔗内生菌菌株对甘蔗抗旱性的影响有明显差异。E3、O9和YC89在提高甘蔗耐旱能力方面效果显著,主要表现在降低细胞膜损伤、增加渗透调节物质的含量、降低膜脂过氧化程度和增加SOD、POD活性等方面。试验发现,产ACC脱氨酶的甘蔗内生菌能更有效提高甘蔗抗旱能力。

甘蔗近缘野生种蔗茅EfGRAS基因克隆及表达分析

为深入挖掘甘蔗品种的抗旱性能,本研究挑选甘蔗品种中参与调控抗旱机制的主要转录因子GRAS的基因进行表达分析。从转录组数据库中调取GRAS转录因子基因序列信息,采用RACE-PCR和qRT-PCR技术从‘蔗茅99-2’中克隆得到1个GRAS基因,将其命名为EfGRAS(GenBank登录号MT499789),并对其进行生物信息学分析与干旱胁迫表达分析。结果表明,EfGRAS基因编码547个氨基酸,CDS全长1644 bp,该蛋白的分子式为C2645H4149N747O816S21,相对分子质量为60.14 kDa,不稳定系数为54.85,脂肪系数为84.37,GRAVY值为‒0.293,是一类不稳定蛋白和亲水蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内,EfGRAS蛋白主要的二级结构是α-螺旋和无规则卷曲,与高粱亲缘关系最近;qRT-PCR分析显示,受到干旱胁迫后,‘蔗茅99-2’中基因表达量相比于对照组上调约57.6倍,‘滇蔗01-58’中基因表达量相比于对照上调约27.4倍,‘崖城89-9’中基因表达量相比于对照组上调倍数较低。本研究结果为进一步研究EfGRAS基因在甘蔗中的功能提供理论基础。

蔗茅WRKY转录因子家族基因鉴定及低温表达模式分析

WRKY转录因子是仅存于高等植物中的一个超级基因家族,在植物的多种应激反应中起着重要作用。为分析蔗茅WRKY基因家族,本研究利用生物信息学方法对蔗茅EfWRKY基因家族进行分析,并在冷胁迫下对EfWRKY基因的表达进行了分析。结果显示,EfWRKY基因的氨基酸数在58~633,分子量在6.47133~67.80718 k D,等电点在5.28~10.04,不稳定指数在25.19~84.29,脂肪系数在32.83~76.69,平均亲水系数在-1.337~-0.111。亚细胞定位显示41个蔗茅WRKY蛋白均在细胞核内。EfWRKY基因家族的二级结构中无规则卷曲占比最高。氨基酸序列比对及与水稻构建进化树分析表明,EfWRKY基因家族含有41个家族成员,共分为Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅲa和Ⅲb 6个组。经Heatmap分析发现41个基因在受到不同程度的冷胁迫下EfWRKY基因都有不同程度的表达。

蔗茅野生种ErDREB1A基因的克隆与表达分析

为了充分利用蔗茅野生资源,培育耐寒转基因甘蔗提供可靠的候选基因,本研究以电子克隆结合RT-PCR的方法,在蔗茅(Erianthus fulvus)野生种(昆明蔗茅99-1)中克隆到1个干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein,DREB)基因。生物信息学分析表明:该基因的ORF长度为720 bp,编码239个氨基酸,具有1个保守的AP2结构域,编码蛋白以α-螺旋和β-折叠为主,无跨膜结构,没有信号肽,具有多个磷酸化位点,命名为ErDREB1A基因(GenBank ID:MK726363)。荧光定量PCR分析表明:在蔗茅野生种中,随着低温胁迫的延时,ErDREB1A基因的表达量逐渐增加,表明该基因表达受低温胁迫诱导。本研究为进一步研究蔗茅低温胁迫下的分子调控网络和培育耐寒转基因甘蔗提供一定科学依据。

蔗茅EfNAC44基因克隆与表达分析

为了克隆蔗茅EfNAC44基因,并对其进行生物信息学和基因表达模式分析。本研究通过转录组测序和RT-PCR方法相结合首次从蔗茅野生种无性系‘蔗茅99-3’中克隆到一个受低温胁迫响应的NAC家族基因,命名为EfNAC44 (GenBank登录号:MH709118.1),该基因包含一个591个碱基的开放阅读框,编码196个氨基酸。利用ClustalX软件将EfNAC44编码蛋白与其他物种NAC蛋白进行同源性比较分析,发现其与高粱(XP002465328.1)同源性最高达80%。荧光定量PCR检测分析表明,该基因在蔗茅苗期能够对低温胁迫响应,低温胁迫时的相对表达量上调达到20倍。以上研究结果可为进一步挖掘利用蔗茅耐寒相关基因以及研究甘蔗抗逆性品种改良提供理论依据和技术支撑。

蔗茅EfNAC基因的克隆和生物信息学分析

为了更好地利用甘蔗野生种蔗茅(Erianthus fulvus Ness.)的抗逆相关基因,并为转基因甘蔗抗逆育种提供可靠的候选基因。本研究利用电子克隆和RT-PCR的方法在蔗茅野生种‘蔗茅99-2’中克隆到一个干旱诱导表达基因,并命名为FfNAC(GenBank登录号:MT499790)。生物信息学分析表明,FfNAC基因ORF长度为765 bp,共编码254个氨基酸,具有一个保守的NAM结构域。编码的蛋白以无规则卷曲和α-螺旋为主,没有信号肽,具有多个磷酸化位点,没有跨膜结构。本研究为深入研究蔗茅干旱胁迫的分子调控机制和转基因甘蔗抗旱育种提供理论依据和技术支撑。