结核杆菌抗原多表位融合蛋白的重组表达与鉴定

目的构建含有6个编码结核杆菌抗原HLA-A0201限制性CD8+CTL表位基因序列的重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达。方法选取结核杆菌抗原Rv0309、Rv0173、Ag85A、Ag85C的6个HLA-A0201限制性CD8+CTL表位,引入Th表位PADRE及木马肽序列,并以RVKR序列作为接头,合成全基因序列,经PCR扩增后插入融合表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹鉴定重组表达蛋白。结果成功构建了结核杆菌多表位蛋白的表达质粒,并经IPTG诱导表达了大小约为40000的融合蛋白。结论多表位融合蛋白的重组表达为进一步开发新型结核疫苗打下了基础。

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8^+CTL表位的预测及鉴定

目的:预测及鉴定结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,为基于表位的结核疫苗研究提供依据。方法:应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HLA-A*0201分子的亲合力,选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞,检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性,逐步鉴定出Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位。结果:SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA-A*0201分子的抗原肽,其中3个抗原肽(170～178 aa、317～325 aa和144～153 aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有高结合力,而抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)能够诱导大多数HLA-A*0201阳性结核患者及PPD(+)健康志愿者产生特异性CTL细胞,并分泌大量的IFN-γ,能够诱导CTL体外发生增殖,能够产生特异性杀伤活性。结论:成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,可作为结核疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础。

大肠杆菌发酵生产重组人颗粒溶素

目的:在FUS-50L生物反应器中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pET28a(+)-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株,生产重组颗粒溶素(GNLY)。方法:选取含pET28a(+)-GNLY的BL21(DE3)pLysS菌株单个克隆分级培养,将制备的二级种子液接种于发酵罐中。在发酵过程中,控制溶氧为30%～50%,温度为37℃;在基础培养基内生长4h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到11h;加入葡萄糖至终浓度为1%,30℃诱导表达6h;收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western印迹检测重组蛋白的抗原性,用CFU方法检测其生物学活性。结果:发酵液中最终菌体密度达80g/L;纯化所得重组蛋白约占菌体总蛋白的5%,含量为60mg/L;经鉴定所获重组颗粒溶素有较好的免疫学活性和生物学活性。结论:用含重组质粒pET28a(+)-GNLY的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达系统,可得到具有生物活性的重组颗粒溶素,为大批量生产提供了条件。

隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体的免疫原性研究

目的探讨纯化的隐球菌抗原肽GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型隐球菌疫苗的研制打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的GMFDGLSGV单体、二聚体、四聚体、八聚体重组蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定重组多聚体的免疫原性。结果10例HLA-A*0201阳性个体PBMC对八聚体的平均SI为37.4±3.07;增殖反应明显高于四聚体(平均SI为20.1±1.37)、二聚体(平均SI为14.1±1.06)、单体(平均SI为11.4±0.68)以及阴性对照(平均SI为1±0.10)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在抗原肽诱导的CTL细胞毒活性中,HLA-A*0201阳性个体PBMC对八聚体、四聚体、二聚体、单体及阴性对照组均表现不同程度的杀伤活性,平均活性分别为48.1±4.28、23.9±2.20、16.3±1.27、13.1±1.10、1.0±0.1(P<0.01)。结论本研究得到的重组优化八聚体具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性,为进一步开发有效的隐球菌疫苗打下了基础。

自身抗原OGDC-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

目的基因工程重组表达2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2(OGDC-E2)融合蛋白。方法用PCR方法扩增得到OGDC-E2的基因片段,插入表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28a(+)-OGDC-E2,测序正确后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。结果获得OGDC-E2融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子质量与预期大小一致;经免疫学鉴定,重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型(AMA-M2)的免疫原性。结论基因重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的实验诊断。

胃癌组织中P33^(ING1)基因mRNA定量分析

P33INGI为1996发现的一种新的抑癌基因,该基因在细胞周期的调控和凋亡的调节中起重要作用,其表达可有效抑制细胞的生长,促进无生长因子条件下的细胞凋亡,同时P33INGI与P53在抑制细胞生长方面有协同和相互依赖作用,在人体多种肿瘤组织中发现P33INGImRNA表达下降.