基于改进的Southern杂交法检测古树木端粒长度的研究

研究旨在利用DNA印迹法测量端粒长度从而预测植物的年龄,但木本植物体内富含黄酮类、酚类、多糖、萜类等次生代谢物质,严重影响了提取的基因组DNA产量和质量,以及后续的酶切及杂交实验结果。笔者以北京颐和园5种古树为实验材料,在传统CTAB法提取DNA基础上,不同树种分别添加2%~6%PVP,可有效去除次生代谢物质对DNA的干扰,可被限制性内切酶HinfⅠ酶切完全。同时,对DNA印迹法的其他实验参数如DNA量、曝光时间进行了优化,并进行了3种不同年龄古树端粒长度测定,结果显示古树的平均端粒长度要高于幼树,本研究建立的实验方法为多年生林木特别是古树端粒长度、树龄检测与寿命预测等提供了参考。

AtTERT启动子结构特征及其对拟南芥非生物胁迫抗性的影响

端粒酶是具有逆转录酶活性的维持真核生物中染色体末端DNA完整性的核糖核蛋白复合物,而端粒酶逆转录酶(TERT,Telomerase reverse transcriptase)是端粒酶的核心组分。目前对TERT启动子的研究主要集中在人体的肿瘤细胞方面,而对植物TERT基因启动子的结构及TERT表达调控机理的研究有所缺乏。本研究通过生物信息学技术对拟南芥TERT启动子结构特征进行了系统分析,并构建植物TERT启动子进化树;用半定量PCR检测野生型和AtTERT启动子区突变体拟南芥幼苗在非生物胁迫下的TRET表达模式。结果表明,系统进化分析显示TERT启动子在同一类群植物中有着较高的保守性;TERT基因启动子具有多个与干旱、盐、激素等相关调控元件;突变体AtTERT转录表达量普遍低于野生型;同时突变体对盐、干旱胁迫抗性降低,而对脱落酸处理不敏感。这说明AtTERT启动子含有抗旱、抗盐反应顺式作用元件,而无响应ABA调控机制,验证了对AtTERT基因启动子的顺式作用元件的预测,并初步证明AtTERT启动子对AtTERT的转录表达具有调控作用,对未来探讨该基因的表达调控机制提供了重要参考。

沙冬青端粒酶逆转录酶基因(AmTERT)克隆及表达分析

利用分段克隆法从沙冬青中得到一条全长为3 459 bp的端粒酶逆转录酶基因(telomerase reverse transcriptase of Ammopiptanthus mongolicus,AmTERT),并对AmTERT进行了系统的生物信息学分析。结果表明,AmTERT编码1 153个氨基酸,蛋白相对分子质量为132.52 k Da,等电点为9.49,属于稳定性较差的亲水性蛋白。未发现跨膜结构存在,定位预测结果显示其在细胞质膜及线粒体上有定位,同时发现其有单分型(NLS-monopartite)和双分型(NLS-bipartite)细胞核定位信号,而在原生质体中的瞬时表达实验结果表明AmTERT定位在细胞核中。该氨基酸序列共有147个潜在磷酸化位点,氨基酸比对结果显示,AmTERT与大豆TERT相似性高达75%。另外,AmTERT蛋白具有端粒酶逆转录酶的保守功能结构域(TRBD及RT),并存在潜在的Akt激酶磷酸化位点,暗示其可能通过磷酸化作用发挥调节自身或其他基因功能的作用。荧光定量PCR结果显示,AmTERT在根中表达量较茎和叶组织都高,盐、干旱、热及低温胁迫均能导致沙冬青幼苗根和叶中AmTERT的表达量升高,说明植物细胞端粒酶可能和动物细胞一样具有应激保护功能。综上,研究结果表明,沙冬青端粒酶可能存在非端粒功能。