组蛋白去乙酰化酶6介导蛋白包涵体-自噬-溶酶体途径在百草枯诱导多巴胺能神经元自噬障碍中的作用

目的探讨组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)介导蛋白包涵体-自噬-溶酶体途径(AALP)在百草枯(PQ)诱导多巴胺能神经元自噬障碍中的作用。方法以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)作为多巴胺能神经元的体外模型,将细胞分为对照组和PQ染毒组(不同浓度PQ处理)。用不同浓度PQ(0、25、50、100、200和400μmol/L)处理细胞24 h,100μmol/L PQ处理细胞不同时间(0、12、24、36、48、60和72 h),CCK-8法检测细胞增殖活性;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞HDAC6、α-突触核蛋白(α-syn)、动力蛋白中链(Dynein IC1/2)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、自噬相关蛋白(Beclin1)、泛素结合蛋白(p62)和溶酶体相关膜蛋白-1(Lamp-1)的表达水平;免疫荧光双标法观察细胞HDAC6、α-syn、Dynein IC1/2、LC3、Lamp-1及γ-微管蛋白(γ-tubulin)在细胞中的表达及定位。结果PQ呈剂量和时间依赖性抑制SH-SY5Y细胞增殖活性(R=-0.950、-0.960,P<0.05);与对照组比较,PQ染毒组HDAC6、α-syn、p62蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),而自噬标志蛋白(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)、Dynein IC1/2、Beclin1、Lamp-1表达水平降低(P<0.05);与对照组比较,PQ染毒组HDAC6与α-syn荧光信号增强,蛋白表达水平增高,而Dynein IC1/2、LC3、Lamp-1荧光信号减少,蛋白表达水平降低(P<0.05);PQ染毒诱导上述蛋白表达位置也发生变化,细胞质中的HDAC6由弥散状逐渐向细胞核聚集;α-syn、Dynein IC1/2、γ-tubulin、LC3、Lamp-1也逐渐由细胞质向细胞核聚集,并与HDAC6在细胞核共定位于核周区域。结论PQ可能通过诱导HDAC6介导蛋白包涵体-自噬-溶酶体途径障碍引起α-syn异常聚集。

miR-7和miR-153抑制α-syn表达在百草枯诱导多巴胺能神经元损伤中的作用机制

目的探讨miRNA-7和miRNA-153在百草枯(PQ)诱导多巴胺能神经元损伤中抑制α-syn表达的作用机制。方法运用TargetScan和HMDD等基因预测软件预测miR-7和miR-153与α-synuclein蛋白编码基因(SNCA)结合位点及与帕金森病相关性。选择高表达内源性α-syn的HEK293T细胞作为转染细胞株,采用化学合成miRNAs模拟物和抑制剂转染HEK293T细胞调控其miR-7和miR-153表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞α-syn基因与蛋白表达水平,观察miR-7和miR-153与内源性α-syn基因表达的关系;为了进一步研究在环境化学物PQ诱导下miR-7和miR-153对α-syn基因的调控作用,以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)作为多巴胺能神经元体外模型,不同浓度PQ(0、25、50、100、200、400和800μmol/L)处理细胞24 h,100μmol/L PQ处理细胞不同时间(0、12、24、36、48、60和72 h),CCK8法检测细胞增殖活性;RT-qPCR检测miR-7、miR-153表达,Western blot检测α-syn蛋白表达水平;对多巴胺能神经元分别转染miRNA模拟物和miRNA抑制剂后再进行PQ诱导24 h,Western blot和RT-qPCR检测α-syn蛋白及基因表达水平。结果生物信息学分析显示,α-syn编码基因(SNCA)3′-UTR有两个片段能够与miR-7(序列120~127)和miR-153(序列459~465)结合;上调HEK293T细胞miR-7和miR-153表达后,α-syn基因和蛋白表达水平均明显下降,尤其在100 nmol/L浓度下降明显(P<0.05);相反,抑制miRNA表达后α-syn基因和蛋白表达水平升高(P<0.05),说明miR-7和miR-153能够靶向下调α-syn基因进而抑制α-syn蛋白表达。进一步使用外源化学物PQ处理多巴胺能神经元,染毒组细胞增殖活性随剂量和时间的增加而下降(P<0.05);细胞内α-syn蛋白表达水平升高(P<0.05);而miR-7和miR-153表达水平明显降低(P<0.05);向细胞转染miRNA模拟物以上调miRNA表达后,α-syn mRNA和蛋白表达均被抑制(P<0.05),而转染miRNA抑制剂抑制miRNA表达,α-syn mRNA及蛋白表达增加(P<0.05)。结论MiR-7、miR-153在PQ诱导多巴胺能神经元损伤中抑制了α-syn基因及蛋白表达。

低浓度百草枯诱导小鼠小胶质细胞异常活化的M1/M2表型变化

目的观察低浓度百草枯(PQ)对小鼠小胶质细胞(BV2)的激活情况,探讨PQ对BV2细胞M1/M2表型变化的影响。方法以BV2细胞为模型,用终浓度0、0.015、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48μmol/L PQ及0.05μmol/L 1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理细胞24 h,CCK8法测定细胞存活率;用终浓度0、0.015、0.03、0.06、0.12μmol/L PQ及0.05μmol/L MPP+处理细胞24 h,酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β含量,Transwell小室法测定细胞迁移能力,免疫荧光法和流式细胞仪测定细胞吞噬能力;用终浓度0、0.03、0.06、0.12μmol/L PQ及0.05μmol/L MPP+处理细胞24 h,蛋白免疫印迹(Western blot)法测定M1型BV2细胞标志物TNF-α、IL-6、IL-1β、一氧化氮合酶(iNOS)、CD86及M2型BV2细胞标志物Ⅰ型精氨酸酶(Arg-1)、甘露糖受体(CD206)的蛋白表达水平。结果与0μmol/L PQ组比较,0.03~0.12μmol/L PQ组BV2细胞增殖活性均明显升高,0.48μmol/L PQ组增殖活性明显抑制,差异均有统计学意义(P<0.05);0.03μmol/L PQ处理24 h的BV2细胞增殖活性明显升高(P<0.05);ELISA结果显示,与0μmol/L PQ组比较,0.03、0.06μmol/L PQ组BV2细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量明显升高(P<0.05);免疫荧光和流式细胞仪测定结果显示,与0μmol/L PQ组比较,0.015、0.03、0.06μmol/L PQ组细胞吞噬能力明显增强(P<0.05);Transwell结果显示,0.03、0.06、0.12μmol/L PQ组细胞侵袭能力较0μmol/L PQ组明显升高(P<0.05);Western blot结果显示,与0μmol/L PQ组比较,0.03、0.06μmol/L PQ组的M1型标志物TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和CD86蛋白表达水平明显升高,0.06、0.12μmol/L PQ组M2型标志物Arg-1、CD206蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论低浓度PQ可以异常激活BV2细胞,使得BV2细胞向促炎型M1型转化而抑制其向抗炎型M2型转化。

百草枯诱导多巴胺能神经元α-突触核蛋白的自噬性降解障碍机制

目的探讨百草枯(PQ)对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)自噬水平的影响及诱导α-突触核蛋白(α-syn)异常聚集的机制.方法以SH-SY5Y细胞作为多巴胺能神经元的体外模型,不同浓度PQ(0、18.75、37.5、75、150、300、600μmol/L)处理细胞24 h,150μmol/L PQ处理细胞不同时间(0、12、24、36、48、60、72、96 h),每组设5个复孔.CCK8法检测细胞相对存活率,确定剂量/时间-效应关系;不同浓度PQ(0、75、150、300、600μmol/L)处理细胞24h,150μmol/L PQ处理细胞不同时间,检测细胞LDH活力;蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞内自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)、自噬相关蛋白(Beclin1)、Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(Vps34)、泛素结合蛋白(p62)及α-syn表达水平;实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测α-syn基因表达水平;免疫荧光法(Immunofluorescencetechnique,IF)检测α-syn表达水平;用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)100 nmol/L预处理细胞6h,Western blot检测处理前后细胞内自噬相关蛋白及α-syn的蛋白表达水平.结果PQ染毒细胞24h后,细胞相对存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).与正常对照组比较,PQ呈剂量依赖性和时间依赖性抑制SH-SY5Y细胞的增殖活性(P<0.05);与正常对照组比较,染毒组细胞上清中LDH活力明显升高(P<0.05);Western blot结果显示,与正常对照组比较,染毒组细胞内自噬相关蛋白比值(LC3II/LC3I)、Beclin1和Vps34蛋白表达水平明显下降(P<0.05),p62蛋白表达水平升高(P<0.05);细胞内α-syn蛋白和基因表达水平均明显升高(P<0.05);IF结果显示,经PQ处理后,细胞内α-syn荧光信号明显聚集于胞质,荧光强度增强(P<0.05);Western blot结果显示,与染毒组比较,RAPA干预组的LC3II/LC3I、Beclin1和Vps34蛋白表达水平明显升高(P<0.05),α-syn蛋白表达水平明显下降(P<0.05).结论PQ可能通过诱导SH-SY5Y细胞自噬功能障碍,引起细胞内α-syn的异常聚集.