猪附红细胞体感染家兔模型的建立

为了建立猪附红细胞体感染家兔模型。将摘除脾脏后的12只家兔随机平均分为3组。A组为模型组,接种2 mL纯化的猪附红细胞体;B组为阴性对照组,接种2 mL猪附红细胞体阴性血液分离物;C组为空白对照组,接种2 mL生理盐水。接种后通过测量体温、体质量、PCR检测、血常规、血液生化指标和病理组织学检验来鉴定猪附红细胞体感染情况。结果显示,A组家兔与B组、C组相比,体温、体质量变化差异显著(P<0.05)。A组家兔出现了消瘦、被毛杂乱、结膜黄染等临床症状。血常规检测结果显示,A组家兔红细胞总数、平均体积、血红蛋白含量均减少,差异显著(P<0.05);血红蛋白、血红蛋白浓度均减少,差异极显著(P<0.01),提示家兔贫血。血液生化指标检测结果显示,A组家兔尿素、白球比、尿酐比,丙氨酸氨基转移酶均升高,差异显著(P<0.05);球蛋白、肌酐、血糖均下降,差异显著(P<0.05),提示家兔免疫力下降,肝功能和肾功能受损。病理组织学观察结果显示,A组家兔肝脏充血、水肿、肺脏局部有炎性细胞、心肌细胞出血。试验结果表明本研究成功建立了猪附红细胞体感染家兔模型。

猪附红细胞体eno基因重组蛋白的制备及免疫效果研究

为了研究猪附红细胞体eno基因重组蛋白的免疫效果,本试验将猪附红细胞体eno基因与pET-15b载体进行连接,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。对表达菌株进行诱导表达、纯化,利用纯化后的猪附红细胞体eno重组蛋白(命名为rMseno)对小鼠进行免疫,从而评价该重组蛋白在小鼠体内产生的免疫应答水平。试验将20只4周龄的雄性昆明小鼠随机分为A、B、C、D 4个组。免疫A组接种纯化后的重组蛋白rMseno;免疫B组接种经IPTG诱导表达后的重组菌E.coli-Mseno;对照C组接种等量PBS;对照D组接种未经过诱导表达的重组菌E.coli-Mseno。通过ELISA检测方法分别测定血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平及γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)细胞因子水平,最后通过脾脏淋巴细胞增殖试验来反映小鼠体内T淋巴细胞的增殖情况。结果显示,构建的重组pET-15b-eno质粒目的基因片段大小为1632 bp,与预期大小相同;纯化的重组蛋白rMseno大小为61 ku,并能够被鼠抗猪附红细胞体血清所识别;免疫A组和免疫B组小鼠血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平以及T淋巴细胞增殖指数均显著或极显著高于对照组(P<0.05;P<0.01)。结果表明,猪附红细胞体eno基因重组蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平以及细胞免疫应答水平。

猪附红细胞体eno基因PCR诊断方法的建立

为建立快速、准确的猪附红细胞体诊断方法,根据GenBank上发布的猪附红细胞体的eno基因序列,设计合成1对特异性引物,通过PCR退火温度筛选出最适温度,将PCR扩增产物进行克隆与测序,并进行特异性试验、敏感性试验及临床应用试验。结果表明:建立的PCR方法扩增出猪附红细胞体eno基因序列大小为170 bp,与GenBank中(序列号AB265823.1)的序列同源性为98%;建立的PCR方法特异性好、敏感性强,具有很好的临床应用价值,该方法为猪附红细胞体病的病原核酸诊断提供了有力支撑。

延边地区鸭弓形虫感染情况的初步调查

为调查延边地区鸭弓形虫感染情况,用间接ELISA法对采自延边地区8个县市的鸭血清304份进行弓形虫抗体检测。结果显示,96份血清呈阳性,血清弓形虫抗体总阳性率为31﹒58%;不同地区阳性率之间有统计学差异(p<0﹒05)。本调查首次证实了延边地区鸭存在弓形虫感染,这对人和动物存在潜在威胁,应该引起相关部门的重视。

弗格森埃希菌生长曲线及半数致死量测定

为测定弗格森埃希菌半数致死量,采用振荡比浊法(Dλ值法)测定弗格森埃希菌的生长曲线,并确定菌液与稀释倍数的关系,利用SPSS软件计算弗格森埃希菌对昆明小鼠的半数致死量(LD50)。结果显示,弗格森埃希菌在LB液体培养基中培养4 h^12 h时生长迅速,为对数生长期,在12 h以后进入稳定期;采用活菌计数法绘制弗格森埃希菌对数生长期OD值与活菌数的函数关系,得到回归方程y=11.09x+0.157,R^2=0.9955,具有良好的相关性;确定了弗格森埃希菌对昆明小鼠的半数致死量LD50为2.944×10^7 CFU,95%置信区间为1.557×10^7~4.817×10^7 CFU。

细胞穿膜肽作为载体的研究进展

细胞穿膜肽是一种包含5~30个氨基酸残基的多肽,其自身不仅可穿透细胞膜,而且不会引起细胞损伤,还可以转运亲水分子(肽、蛋白质和核酸)以及纳米粒子等生物大分子物质进入胞内进入细胞后可降解。由于细胞穿膜肽具有上述优点,近年来细胞穿膜肽已在肿瘤靶向治疗、新药开发、基因治疗和细胞转染载体等方面的研究取得了显著的进展。本文对细胞穿膜肽的分类、国内外的研究现状以及在各领域的应用进行综述。

猪附红细胞体eno基因重组蛋白对仔猪免疫效果研究

为了研究猪附红细胞体eno基因重组蛋白对仔猪的免疫效果,本研究将9头仔猪随机平均分为3组:免疫组A皮下多点注射免疫纯化的猪附红细胞体重组蛋白rMseno,剂量为2.5 mg/头;免疫组B皮下注射免疫诱导后的重组菌Mseno/E.coli裂解液,剂量为5×10^(8)cfu/头;对照组C接种等量PBS;共免疫2次,2次免疫间隔21 d。在一免后0、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d采集仔猪血清,通过间接ELISA方法检测血清中重组蛋白特异性抗体、IgG_(1)、IgG_(2a)、细胞因子IFN-γ和IL-4水平;流式细胞术检测免疫仔猪CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞水平,评价重组蛋白对仔猪的免疫效果。间接ELISA方法检测结果显示,免疫组A和免疫组B猪血清中重组蛋白特异性抗体、IgG_(1)、IgG_(2a)、细胞因子IL-4和IFN-γ水平均极显著高于对照组C(p<0.01);流式细胞术检测结果显示,免疫组A和免疫组B CD4^(+)T细胞水平极显著高于对照组C(p<0.01);免疫组A和免疫组B的CD8+T细胞水平和CD4^(+)T细胞/CD8+T细胞比值显著高于对照组C(p<0.05);免疫组A与免疫组B比较,上述所测指标均差异不显著(p>0.05)。结果表明,猪附红细胞体eno基因重组蛋白能诱导仔猪产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,纯化后的重组蛋白与表达重组蛋白的重组菌裂解液所诱导的免疫效果差异不显著。本研究首次证实猪附红细胞体eno基因重组蛋白对仔猪的免疫效果,为猪附红细胞体病亚单位疫苗的研发提供参考依据。

1种CPPs调节瑟氏泰勒虫病DNA疫苗免疫应答

人工合成一种细胞穿膜肽,制备穿膜肽-DNA疫苗复合物,先将其转染Vero细胞,采用间接免疫荧光抗体试验(IFTA)鉴定目的基因在Vero细胞中的表达;再将40只6周龄雌性昆明小鼠分为CPPs-pVAX1-P33、pVAX1-P33、pVAX1和PBS 4个组;分别肌肉注射相应免疫原,采用ELISA方法检测CPPs血清中IgG抗体水平和IL-4、IFN-γ细胞因子水平;在三免2周后检测小鼠脾脏中CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)含量。结果显示,CPPs-pVAX1-P33复合物成功转染到Vero细胞,并在其中获得表达;CPPs-pVAX1-P33免疫组昆明小鼠血清中IgG抗体水平,IL-4和IFN-γ细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)含量均显著或极显著高于pVAX1-P33(P<0.05或P<0.01)。结果表明,本试验制备的CPPs能显著诱导瑟氏泰勒虫DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫应答反应。

基于蛋白芯片技术对猪附红细胞体感染小鼠血清差异蛋白的筛选

为了筛选猪附红细胞体感染小鼠血清的差异蛋白,探讨猪附红细胞体病的致病机制。本试验利用分离纯化后的猪附红细胞体感染昆明种小鼠,设立空白对照组、阴性对照组。经PCR鉴定感染成功后,采集感染小鼠和未感染小鼠血清进行蛋白芯片检测,获取差异蛋白并进行层次聚类分析、功能聚集分析以及KEGG通路富集分析,并对筛选出的细胞因子进行ELISA定量检测验证。结果显示,蛋白芯片检测共筛选出5个差异蛋白,分别是白介素1α(IL-1α)、白介素2(IL-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、催乳素Prolactin和神经纤毛蛋白1(Neuropilin-1)。KEGG通路富集分析结果显示:5种差异蛋白主要参与细胞因子与细胞因子受体的互作通路、JAK-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路以及MAPK信号通路。ELISA定量检测结果显示,筛选出的5个差异蛋白含量均显著上升(P<0.05),与蛋白芯片试验结果一致。猪附红细胞体感染可引起小鼠血清中的IL-1α、IL-2、VEGF、Prolactin和Neurpilin-1细胞因子水平显著升高。

一种CPPs介导的基因转化方法的建立及其应用

为了弥补常规基因转化法存在的缺点,本研究采用琼脂糖凝胶电泳分析法探讨了细胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)与DNA的最适比例,用转化率探讨了CPPs-DNA复合物的制备条件、保存条件和解冻条件等对CPPs基因转化的影响,再用CPPs基因转化法进行了牛瑟氏泰勒虫p33基因的克隆与原核表达,进一步验证CPPs基因转化的可行性。结果表明,CPPs与质粒pMD19-T最适电荷比为16∶1;CPPs-DNA复合物的最适制备条件为室温孵育30 min;将培养液D_(600)约为0.6的大肠杆菌菌液在-20℃冰箱保存3月的转化率为(5.58±0.19)×10^(5) CFU/μg,仍符合常规转化要求。按照所优化的条件成功地克隆与表达了牛瑟氏泰勒虫p33基因。本研究结果将为基因转化提供一种新方法。