牛支原体等温扩增冻干试剂盒研究

【目的】牛支原体(Mycoplasma bovis)是导致牛多种疾病综合征的病原体之一,在世界范围广泛流行。为了有效监测此病在中国的流行情况,迫切需要敏感、便捷的诊断试剂产品。【方法】通过构建含有牛支原体uvrC基因片段的重组质粒并转化TOP10感受态细胞,获得重组大肠杆菌rP-uvrC。重组大肠杆菌大量表达并提取重组质粒后,获得质粒浓度为10~4拷贝/μL的溶液,作为质控用阳性对照品。根据文献报道的浓度配制甜菜碱溶液和显色液(主成份为SYBR Green I和HNB),分别作为冻干品溶解用溶液和等温扩增产物显色溶液。在已建立的牛支原体环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术的基础上配制等温扩增试剂,并通过考察等温扩增反应情况在常用的8种冻干疫苗耐热保护剂中选择对等温扩增反应没有影响的3种冻干保护剂,每种保护剂分别选用3种不同的浓度,共设计27种保护剂组方,通过观察冻干品物理性状选择最佳的一组保护剂配制冻干用等温扩增试剂,放到冻干机中测定共晶点,并优化一次干燥升温时间、干燥时间和二次干燥时间。通过对冻干制品物理性状的检验、真空度的检测以及残余水分含量的测定,筛选出一条适合等温扩增试剂的冻干曲线,并以此制备等温扩增试剂冻干品。取一定量等温扩增试剂冻干品、甜菜碱溶液、阳性对照品溶液和显色液,组装成试剂盒。利用6个浓度梯度(10~0-10~5个拷贝)重组质粒溶液检测试剂盒的敏感性,利用浓度为10~4 CCU·mL^(-1)的PG-45株、HB-1株、SD-2株牛支原体菌液、10~8CCU·mL^(-1)的牛鼻支原体和无乳支原体菌液、10~8CFU·mL^(-1)的多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌,检测试剂盒的特异性。另外,将等温扩增冻干试剂盒分别置于不同温度下保存,检测其稳定性。【结果】8种冻干保护剂中只有海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白不影响等温扩增反应,在此基础上优选的冻干保护剂配方为5%海藻糖+1.25%甘露醇+1.25%牛血清白蛋白,等温扩增试剂共晶点为-16℃,一次干燥的升温时间3h,一次干燥时间6h,二次干燥时间4 h。组装后的试剂盒最低可检测到10个拷贝数的重组质粒,检验PG45株、HB-1株以及SD-2株牛支原体均为阳性,检验牛鼻支原体、无乳支原体、多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌均为阴性。试剂盒在20℃保存6个月、37℃保存10 d后,敏感性仍为10个拷贝数,与第0天相同,推测4℃保存有效期为24个月左右。【结论】笔者研制的等温扩增冻干试剂盒敏感性高、特异性好、稳定性好、操作便捷,适合基层兽医现场检测使用。

厄瓜多尔CCS水电站施工环境保护管理

辛克雷水电站施工至今,中水电做到了环境问题零投诉,合同整体环境履约完成90%以上,2014年10月份,国际河流组织对项目部进行环保方面现场调研,对比其他水电建设项目,评估报告中指出中水电海外项目环保执行到位。

TBM在CCS水电站输水隧洞施工中的应用

TBM是集成隧道掘进、支护、出渣等施工工序并行连续作业的流水线施工装备,具有掘进速度快、环保、综合效益高的优点,可实现传统钻爆法难以实现的复杂地理地貌深埋长隧洞的施工。两台TBM在厄瓜尔多CCS水电站24.8km长输水隧洞获得了成功应用,提高了输水隧洞的施工效率。

鸭疫里默菌环介导等温扩增检测方法的建立

采用对应于鸭疫里默菌16SrRNA基因442~461bp序列的5条特异引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)反应体系,加入试剂盒提取的鸭疫里默菌DNA后,置63℃反应60min,通过监测反应液浊度判断结果。在此基础上,用煮沸10min的方法代替试剂盒提取DNA方法,并用显色方法代替浊度检测和琼脂糖凝胶电泳方法判断结果,通过敏感性、特异性、病原消长规律试验验证方法的准确性。另外,对临床采集的135只患病鸭的心血、脑组织、肝脏和心脏共540份样品提取DNA后,用LAMP和PCR进行检测,同时进行细菌分离和鉴定,比较各种方法检测结果的符合率。结果显示,菌液提取DNA后,LAMP和PCR方法最低分别可检测到2和10个CFU的鸭疫里默菌。菌液煮沸代替试剂盒提取DNA方法,使LAMP的敏感性降低5倍。显色法、浊度检测和琼脂糖凝胶电泳方法判断结果的敏感性和特异性相同。细菌分离法共获得201株鸭疫里默菌,且经LAMP与PCR法检测均呈阳性,LAMP与PCR法检出阳性样本总数分别为271和254份,LAMP方法阳性检出率高于PCR方法。建立的鸭疫里默菌LAMP检测方法具有较高的敏感性,进一步用菌液煮沸方法代替DNA提取法虽然使敏感性降低5倍,但节省了DNA提取步骤,再结合显色技术使反应结果直观可见,使其临床应用更加便捷。