指状青霉V-ATP酶H亚基蛋白的功能

目的:通过基因干扰和过表达技术,研究V-ATP酶H亚基(V-ATPase membrane subunit H,VMAH)蛋白在柑橘绿霉病菌指状青霉生长中的生理功能,及其作为抗柑橘绿霉病药物作用靶点的可行性。方法:采用菌丝生长法和孢子萌发法,研究沉默和过表达VMAH基因对正常和胁迫条件下指状青霉细胞生长特性的影响。结果:在正常生长条件下,沉默VMAH基因显著抑制了指状青霉菌丝体的生长;而过表达VMAH基因对菌体生长表现出显著促进作用。在不同pH值环境下,沉默VMAH基因显著抑制了指状青霉菌丝的生长,尤其在偏酸性(pH值低于2)和偏碱性(pH值高于8)条件下尤为显著;而过表达VMAH基因在一定程度上促进了菌体菌丝的生长,pH值为6时,其促进作用最显著。与野生株相比,沉默VMAH基因对胞外Ca^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)等金属离子胁迫处理较为敏感。VMAH基因沉默菌株对质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性显著增加,尤其V-ATP酶专一性抑制剂巴佛洛霉素A_(1)最为明显;而VMAH基因过表达菌株对质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性显著降低。结论:VMAH在指状青霉生长过程中发挥重要作用,是研发低耐药性柑橘采后杀菌剂的潜在作用靶点。

VmaH和PMA在指状青霉中的表达及其作为潜在杀菌作用靶点的可能性

目的:研发安全、高效、具有新型作用靶点的杀菌剂,在对指状青霉(Penicillium digitatum)VmaH和PMA进行生物信息学和表达模式分析的基础上,进一步探讨两个基因作为潜在杀菌作用靶点的可能性。方法:以指状青霉为实验材料,使用Pfam、MEGA 5.0等在线软件对VmaH和PMA的编码蛋白进行生物信息学分析,进一步利用实时聚合酶链式反应技术分析VmaH和PMA在指状青霉中的表达规律。结果:结构域预测发现,VmaH具有2个非常保守的结构域,分别为N端结构域和C端结构域;PMA具有3个非常保守的结构域,分别为N端结构域、E1-E2 ATPase结构域和水解酶结构域。同源比对结果发现真菌物种中VmaH和PMA的氨基酸相似度分别为79%、80%,表明不同真菌间VmaH和PMA高度保守。进化树分析显示指状青霉VmaH和PMA与青霉属和曲霉属的VmaH和PMA具有较近的亲缘关系。相较于PMA,VmaH在指状青霉的整个生长过程中一直保持较高的表达水平,而PMA的基因表达水平在指状青霉生长后期显著下调。葡萄糖饥饿显著降低了VmaH和PMA的基因表达水平,葡萄糖回补可以恢复两个基因的表达水平,尤其是VmaH的表达量会显著上调。极酸极碱条件下VmaH和PMA的表达量均显著下调,弱酸和弱碱性环境使PMA基因的表达量增加。氧化、还原剂处理均能显著降低VmaH和PMA的表达水平,且PMA的下调尤为显著。PMA在不同杀菌剂处理条件下表达量均显著下降;而VmaH对不同杀菌剂处理的响应有所差异。结论:通过VmaH和PMA的生物信息学和表达规律分析,可以将VmaH和PMA所编码的蛋白作为指状青霉潜在杀菌作用靶点进行深入研究。

从临床药物中筛选抑制梨果实采后青霉病的活性物质

扩展青霉(Penicillium expansum)是引起水果采后腐烂变质的重要致病菌,有效控制扩展青霉的生长对减少水果采后损失具有重要意义,"老药新用"为抗菌药物的开发提供了快速有效的途径。本研究采用孢子萌发法,以扩展青霉为靶标菌株,研究了26种以干扰生物体细胞膜功能和能量代谢为主要作用方式的临床药物对扩展青霉的抑制作用。结果表明:硝酸咪康唑、克霉唑、联苯苄唑、酮康唑、5-氟胞嘧啶、纳他霉素、依布硒对扩展青霉具有显著的抑制效果,其半最大效应浓度(median effective concentration,EC50)均低于2μg/mL;其中,成本低廉的联苯苄唑EC50为0.04μg/mL。进一步研究发现,联苯苄唑能够显著抑制扩展青霉菌丝体的生长,且分别在温度25、50、75℃,含K+、Mg2+、Na+、Ca2+和中性、弱碱性条件下联苯苄唑的抑菌稳定性没有显著影响,但紫外照射会降低联苯苄唑对扩展青霉的抑制效果。体外接种实验结果表明,联苯苄唑处理可以显著减小‘皇冠梨’果实采后病斑直径(P<0.05),有效控制‘皇冠梨’果实采后青霉病的发生。因此,从临床药物中筛选适合水果采后防腐保鲜的抗菌剂具有可行性,联苯苄唑在皇冠梨采后病害控制中具有潜在的应用价值。